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大豆巯基肽的共价色谱法制备 及其MALDI-TOF-MS分析

发布日期:2017-12-15 10:29来源:中国油脂网作者:未知点击次数:

丁秀臻,孔祥珍,陈业明,张彩猛,华欲飞
(江南大学 食品学院,食品科学与工程国家重点实验室,江苏 无锡 214122)


摘要:建立了一种从复杂的大豆球蛋白酶解物中提取巯基肽的高选择性方法。首先,对大豆球蛋白酶解物中的二硫键用1,4-二硫苏糖醇进行还原,对还原剂的用量进行了考察和优化,提高了酶解物中的巯基肽含量。然后用Thiopropyl-Sephrose 6B共价色谱制备还原酶解物中的巯基肽,对共价色谱的吸附、解吸条件进行了考察和优化。研究表明:二硫键还原最佳1,4-二硫苏糖醇用量为20 mmol/L,还原之后酶解物中的巯基含量从1.8 μmol/g 提高到了 113.8 μmol/g。共价色谱的最佳条件为还原酶解物的上样量为酶解物中巯基含量占凝胶活性位点的80%,键合时间30 min;解吸时1,4-二硫苏糖醇浓度20 mmol/L,解吸时间20 min。此外,C18柱可以有效地将巯基肽中的1,4-二硫苏糖醇和2-巯基吡啶去除。MALDI-TOF-MS分析表明制备的巯基肽中可检测到45个肽段,其中36个肽段含有巯基,表明Thiolpropyl-Sepharose 6B共价色谱对巯基肽有很高的选择性。
关键词:大豆球蛋白酶解物;巯基肽;还原;Thiolpropyl-Sepharose 6B;MALDI-TOF-MS
中图分类号:TS229;TQ937   文献标识码:A

文章编号:1003-7969(2016)12-0031-06
 

Preparation of soy thiol-containing peptides by covalent chromatography
method and its MALDI-TOF-MS analysis 
DING Xiuzhen,KONG Xiangzhen,CHEN Yeming,ZHANG Caimeng, HUA Yufei 
(State Key Laboratory of Food Science and Technology,School of Food Science and
Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,Jiangsu,China)


Abstract:A highly selective method to extract thiol-containing peptides from complicated soy glycinin hydrolysates was established. Firstly,the disulfide bonds in soy glycinin hydrolysates were reduced by 1,4-dithiothreitol. The dosage of reduction agent was optimized and investigated and the content of thiol-containing peptides in the hydrolysates was improved. Then,the thiol-containing peptides in reduced hydrolysates were prepared by Thiopropyl-Sephrose 6B covalent chromatography,and the adsorption and desorption conditions of the covalent chromatography were optimized and investigated. The results showed that the optimal dosage of 1,4-dithiothreitol for disulfide bond reduction was 20 mmol/L. After reduction,the content of sulfhydryl groups in hydrolysates increased from 1.8 μmol/g to 113.8 μmol/g. The optimal covalent chromatography conditions were obtained as follows:the content of sulfhydryl groups 80% of the gel active sites as the optimal loading amount of the thiol-containing peptides,adsorption time 30 min,1,4-dithiothreitol concentration for desorption 20 mmol/L,desorption time 20 min. In addition,1,4-dithiothreitol and 2-mercaptopyridine were removed from thiol-containing peptides successfully by C18 column. MALDI-TOF-MS showed that 45 peptide fragments were detected in thiol-containing peptides and 36 peptide fragments of them contained sulfhydryl groups,which indicated that Thiolpropyl-Sepharose 6B covalent chromatography showed high selectivity toward thiol-containing peptides.
Key words:soy glycinin hydrolysates; thiol-containing peptides; reduction; Thiopropyl-Sephrose 6B; MALDI-TOF-MS


  巯基化合物可以增强食品安全,改善食品营养,有很高的应用价值。研究表明巯基化合物可以抑制食品中黄曲霉毒素B1的致突变活性[1],从而提高食品的安全性。食品中的蛋白质在碱性处理过程中可能会产生脱羟丙氨酸,进一步形成赖氨酸丙氨酸,赖氨酸丙氨酸能够引起小鼠近端肾小管黏膜组织的病变[2]。巯基化合物与脱羟丙氨酸有很强的反应活性从而抑制赖氨酸丙氨酸的形成[3]。巯基化合物还可以降低豆类中蛋白酶抑制剂的活性提高豆类的生物利用率[4]。巯基化合物已经成功应用在临床上来治疗各种疾病,例如丙烯腈中毒、酒精和对乙酰氨基酚引起的胃损伤、三环类抗抑郁药安咪奈丁引起的肝脏坏死及口腔肿瘤等[5-8]。另外,巯基肽,如谷胱甘肽、植物螯合肽和金属球蛋白,是动植物体内重要的重金属解毒因子[9]。合成的巯基肽也展现出了很强的抗氧化活性[10-12]。巯基化合物这些很强的活性与其特有的巯基基团密不可分[13]。
     大豆球蛋白酶解物中的巯基肽主要有3个特点:①绝大多数以没有活性二硫键的形式存在;②相对于非巯基肽,巯基肽含量极低并且分布不集中;③巯基肽中的巯基易氧化为二硫键。因此,大豆球蛋白酶解物中的巯基肽不适于用传统的连续色谱分离的方法进行制备。本研究采用高通量、高选择性的共价色谱法制备巯基肽。首先将大豆球蛋白酶解物中的二硫键还原为游离巯基,提高巯基肽的含量,然后用共价色谱法富集制备还原酶解物中的巯基肽,并对还原剂的用量和共价色谱的制备条件进行了考察和优化,最后用MALDI-TOF-MS对共价色谱的专一性进行了确认。
1 材料与方法
1.1 实验材料
     低温脱脂豆粕,山东万德福有限公司;Alcalase 2.4 FG,诺维信生物技术有限公司;4,4-二硫二吡啶(4-DPS)、碘乙酰胺(IAM)、N-乙基马来酰亚胺(NEM),Sigma公司;1,4-二硫苏糖醇(DTT)、C18填料,Merck公司;Sephadex LH-20、Thiopropyl-Sepharose 6B凝胶,GE公司;十二烷基硫酸钠(SDS)、三氟乙酸(TFA),国药集团;乙腈,色谱纯;其余试剂均为分析纯。
     D-2000 Elite 高效液相色谱仪、Himac CR21GⅡ型冷冻离心机,日本 Hitachi公司;LGJ-18 型冷冻干燥机;HH-5 数显恒温循环水浴锅;Delta 320s 型pH计,梅特勒-托利多公司;UltrafleXtreme 基质辅助离子解吸-飞行时间-质谱仪,布鲁克公司。
1.2 实验方法
1.2.1 大豆球蛋白的制备
     将低温脱脂豆粕粉碎后分散在pH 8.0的30 mmol/L 的Tris-HCl缓冲液(含10 mmol/L 2-巯基乙醇)中,使低温脱脂豆粕和缓冲液的比例为1∶ 10,搅拌1.5 h后用纱布过滤。滤液于4 ℃条件下9 500 r/min离心30 min。用2 mol/L HCl将上清液pH调至6.4后,在4 ℃ 9 500 r/min条件下离心 30 min。将得到的蛋白质沉淀分散在水中,用2 mol/L NaOH调节pH 到8.0,使蛋白质沉淀充分溶解。蛋白质溶液用去离子水透析脱盐后,冷冻干燥,置于-20 ℃冰箱中备用[14]。
1.2.2 大豆球蛋白酶解物的制备
     大豆球蛋白质量浓度为50 g/L,加酶量为大豆球蛋白质量的5%,酶解pH 8.0,50 ℃酶解6 h。酶解结束后,4 000 r/min离心30 min,取上清液冷冻干燥,即得到大豆球蛋白酶解物。
1.2.3 大豆球蛋白酶解物的还原
     酶解物中二硫键的还原采用DTT来进行[15]。将酶解物按50 g/L溶解在含DTT的pH 8.0的10 mmol/L的Tris-HCl缓冲液中, 50 ℃还原30 min。改变DTT浓度,使DTT浓度从0 mmol/L增加到100 mmol/L,考察DTT用量对最终还原酶解物中巯基含量的影响。还原结束后,用2 mol/L的HCl将酶解物pH调到3.0,溶液离心(10 000×g,15 min)、过膜(Φ 50 mm × 0.22 μm)后,用Sephadex LH-20(45 cm×1.2 cm)去除溶液中过量的DTT,上样量为10 mL,流动相为1 mmol/L的HCl。
1.2.4 还原酶解物中巯基含量的测定
     参照Riener等[16]的方法,采用4-DPS法测定酶解物中巯基的含量。
1.2.5 酶解物中巯基肽的制备
     还原酶解物中的巯基肽用Thiopropyl-Sepharose 6B共价色谱静态吸附法进行制备[17]。将Thiopropyl-Sepharose 6B凝胶用去离子水溶胀好之后,用50倍柱体积的去离子水冲洗干净转移到塑料试剂瓶中。用2 mol/L NaOH将还原酶解物pH调到75,加入0.5% SDS之后立即转移到塑料试剂瓶中,在高纯氮气的保护下,室温下轻轻摇晃进行巯基肽的键合。键合结束后的凝胶用2倍柱体积的0.5%SDS和10倍柱体积的去离子水洗掉未键合的非巯基肽组分。键合的巯基肽用含有不同浓度DTT的10 mmol/L的Tris-HCl缓冲液在室温下解吸,解吸液的体积为1倍柱体积,解吸两次。解吸液中的DTT、配基(2-巯基吡啶)及盐离子用C18柱进行脱除。C18柱的解吸液为含01% TFA的80%乙腈溶液。解吸得到的巯基肽用高纯氮气吹干乙腈进行浓缩。
1.2.6 尺寸排阻-高效液相色谱(SEC-HPLC)测定
     还原酶解物中的DTT含量,巯基肽中DTT和2-巯基吡啶的含量采用SEC-HPLC进行测定[18]。色谱柱:TSK gel G2000SWXL(300 mm×7.8 mm);流动相:乙腈-水-三氟乙酸(体积比45∶ 55∶ 0.1);检测波长:DTT为214 nm,2-巯基吡啶为343 nm;流速:05 mL/min;柱温:25 ℃。
1.2.7 巯基肽中巯基的烷基化及基质辅助离子解吸-飞行时间-质谱(MALDI-TOF-MS)分析
     巯基肽用IAM和NEM分别处理后,采用相对分子质量差异质谱进行进一步分析。从Thiopropyl-Sepharose 6B凝胶上解吸下来的巯基肽分为两部分:一部分加入80 mmol/L的IAM,黑暗中25 ℃反应20 min;另一部分加入80 mmol/L的NEM,25 ℃反应15 min。
     MALDI-TOF-MS:将0.7 μL烷基化后的样品滴加到MALDI不锈钢靶上,自然干燥后,滴加0.7 μL 的α-氰基-4-羟基肉桂酸或者2,5-二羟基苯甲酸,干燥后用MALDI-TOF-MS仪得到质谱数据,用FlexAnalysis软件进行分析。相对分子质量误差设置为0.5 Da。
1.2.8 数据处理
     实验数据采用SPSS13.0软件进行方差分析。
2 结果与讨论
2.1 大豆球蛋白酶解物中二硫键的还原
     大豆球蛋白中半胱氨酸含量为113.8 μmol/g,游离巯基的含量为3.9 μmol/g[14],即96.6%的半胱氨酸是以氧化态二硫键的形式存在,根据我们以前的实验结果酶解过程中游离巯基会发生部分氧化。因此,为了提高巯基肽的得率,需要将酶解物中的二硫键还原为游离巯基。本实验采用DTT还原酶解物中的二硫键,图1给出了DTT用量对还原酶解物中巯基含量的影响。
    

QQ截图20171215102429
    

图1 DTT浓度对还原酶解物中巯基含量的影响
  从图1可以看出,当DTT浓度为0~5 mmol/L时,还原酶解物中的游离巯基含量直线上升,当DTT浓度为5~20 mmol/L时,随着DTT浓度的增加,还原酶解物中的游离巯基的增加速率逐渐变得平缓,当DTT浓度增大到20 mmol/L之后,进一步提高DTT浓度,还原酶解物中游离巯基含量变化不显著(P>0.05)。因此,选用20 mmol/L DTT来还原大豆球蛋白酶解物中的二硫键。
     同时,我们还可以发现,20 mmol/L DTT中游离巯基的含量远大于大豆球蛋白中半胱氨酸的含量,过量的DTT会与巯基肽竞争共价色谱凝胶的吸附位点,从而消耗大量的凝胶。因此,需要将过量的DTT脱除。
     DTT的脱除采用Sephadex LH-20进行[19]。Sephadex LH-20采用的流动相为1 mmol/L HCl,能够有效地防止制备过程中游离巯基的氧化。图2给出了典型的还原酶解物的Sephadex LH-20流出曲线,样品为100 mmol/L DTT还原的酶解物。从图2可以看出,还原酶解物被很好地分为了两个部分,其中峰1为酶解物,峰2为DTT。酶解物采用SEC-HPLC未能检测到DTT(见图7)。
    

QQ截图20171215102446
    

图2 100 mmol/L DTT还原酶解物的

 Sephadex LH-20色谱图
  经过还原之后,酶解物中的游离巯基从1.8 μmol/g提高到了113.8 μmol/g,提高了62.2倍。还原后酶解物中巯基含量与Wolf[14]测定的还原大豆球蛋白中巯基含量一致。实验结果表明DTT还原结合Sephadex LH-20分离的方法是提高大豆球蛋白酶解物中游离巯基含量的有效方法。
2.2 还原酶解物中巯基肽的富集
2.2.1 巯基肽吸附条件的优化
     大豆球蛋白还原酶解物中的巯基肽采用Thioproply-Sepharose 6B共价色谱法进行制备。为了使凝胶的应用价值达到最大,以巯基肽的吸附量为指标对酶解物的上样量进行了优化。酶解物的上样量以酶解物中的巯基含量占凝胶中配基的百分含量来表示,巯基的吸附量以吸附的巯基量占配基的百分含量来表示。图3给出了酶解物上样量对巯基肽吸附量的影响。
    

QQ截图20171215102457
    

图3 酶解物上样量对巯基肽吸附量的影响
  从图3可以看出,随着酶解物上样量的增大,巯基肽吸附量先逐渐增大后达到最大值,上样量为20%~80%时,巯基肽吸附量直线上升,继续增大上样量,巯基肽吸附量与上样量为80%时相比没有显著变化(P>0.05),说明80%的上样量为最佳上样量。从图3还可以看出,当酶解物上样量小于80%时,酶解物上样量与巯基肽吸附量之间线性关系显著(R2=0.999,P<0.05),斜率为0.84,接近1,说明当酶解物上样量小于80%时,巯基与填料的活性二硫键是等比例反应。斜率比1略低,可能是由于巯基肽中含有少量的具有两个巯基的巯基肽,这种巯基肽容易形成环状结构[17],从而不能与配基结合。
     图4给出了吸附时间对巯基肽吸附量的影响。
    

QQ截图20171215102511
    

图4 吸附时间对巯基肽吸附量的影响
  从图4可以看出,在吸附的前10 min巯基肽的吸附量直线上升,随着吸附时间的延长吸附速率逐渐降低,30 min 时吸附量达到最大,继续延长吸附时间吸附量变化不显著。巯基肽的吸附分为3个阶段:第1阶段,快速吸附期;第2阶段,缓慢吸附期;第3阶段,吸附平衡期。第1阶段的快速吸附可归因于凝胶表面大量的吸附位点与巯基肽的吸附。第2阶段吸附速率变缓,可能是由于巯基肽与凝胶孔内配基吸附时受到了孔内扩散阻力的影响。巯基肽的最佳吸附时间为30 min,巯基肽的吸附速率要快于巯基蛋白的吸附,这可能是由于在吸附过程中巯基肽的空间位阻要小于巯基蛋白的空间位阻。
2.2.2 巯基肽解吸条件的优化
     吸附在凝胶上的巯基肽采用DTT在10 mmol/L pH 8.0的 Tris-HCl中25 ℃进行解吸。为了提高解吸效率,以解吸率为指标,对解吸时DTT浓度和解吸时间进行了优化。巯基肽的解吸率是解吸的巯基肽的量占吸附的巯基肽的量的百分含量。巯基肽的量用SEC-HPLC图总面积来表示。DTT浓度对巯基肽解吸率的影响如图5所示。
    

QQ截图20171215102521
    

图5 DTT浓度对巯基肽解吸率的影响
  从图5可以看出,当DTT浓度为0~20 mmol/L时,巯基肽的解吸率直线上升,20 mmol/L DTT可以解吸得到84.8%的巯基肽,进一步提高DTT浓度,巯基肽的解吸率不再上升,说明20 mmol/L是解吸时最适的DTT浓度。同时从图5还可以发现,并不能解吸得到100%的巯基肽,损失部分的可能是由于凝胶孔隙的截留作用。根据吸附前还原酶解物和巯基肽各自的SEC-HPLC图总面积,巯基肽占总酶解物的3.2%。
     解吸时间对巯基肽解吸率的影响如图6所示。从图6可以看出,与巯基肽的吸附过程类似,在前10 min,巯基肽的解吸速率很快,这可能是归因于DTT对二硫键有很强的亲和力,同时最初解吸的是凝胶表面吸附的巯基肽。10~30 min巯基肽的解吸率进一步提高但是速率变缓,这段时间主要是凝胶孔隙内巯基肽的解吸。
    


 QQ截图20171215102534   

图6 解吸时间对巯基肽解吸率的影响
2.2.3 巯基肽的进一步纯化
     从Thiopropyl-Sephrose 6B凝胶上解吸下来的巯基肽含有DTT和2-巯基吡啶两种含巯基的杂质,图7给出了两者的SEC-HPLC图。
    

QQ截图20171215102548
    

图7 大豆球蛋白还原酶解物和巯基肽的SEC-HPLC图
  从图7可以看出,DTT在214 nm有一定的吸收,出峰时间为22.5 min,2-巯基吡啶在343 nm有一定的吸收,出峰时间为23.7 min。为了测定巯基肽中是否含有DTT和2-巯基吡啶,我们对巯基肽在SEC-HPLC中214 nm和343 nm的色谱吸收进行了测定。巯基肽在214 nm的色谱峰集中在18~22 min,在22.5 min处的色谱峰非常小,说明DTT被C18柱去除得比较干净。巯基肽在343 nm处没有色谱峰,说明2-巯基吡啶已被完全去除。最终得到的巯基肽的巯基含量为893.7 μmol/g。
2.3 共价色谱对巯基肽的专一性
     Thiopropyl-Sephrose 6B共价色谱对巯基肽的专一性采用MALDI-TOF-MS进行确定。制备的巯基肽中的巯基肽和非巯基肽采用相对分子质量差异质谱进行区分:制备的巯基肽分别加入烷基化试剂IAM和NEM之后用MALDI-TOF-MS分别对其中肽段的相对分子质量进行测定。非巯基肽由于不与烷基化试剂反应,处理前后相对分子质量不会发生变化。巯基与IAM反应后相对分子质量增加57.06,与NEM反应后相对分子质量增加125.13,两者相对分子质量差异为68.07。因此,含有1个巯基的巯基肽处理前后相对分子质量相差68.07,含有n个巯基的巯基肽处理前后相对分子质量相差n×68.07。用MS自带软件进行分析,相对分子质量相同的肽段为非巯基肽,相对分子质量有差异的肽段为巯基肽。MALDI-TOF-MS确定结果如表1所示。

表1 MALDI-TOF-MS确定结果

编号
相对分子质量
IAM NEM
相对分子
质量差异巯基数目
1 198.774 198.769 -0.005 0
2 274.156 274.149 -0.007 0
3 284.220 284.222 0.002 0
4 312.920 312.911 -0.009 0
5 318.220 318.202 -0.018 0
6 833.497 833.400 -0.097 0
7 905.439 905.408 -0.032 0
8 992.494 992.485 -0.009 0
9 1 169.603 1 169.569 -0.033 0
10 249.849 318.202 68.353 1
11 315.021 383.135 68.113 1
12 335.026 403.133 68.106 1
13 482.176 550.227 68.051 1
14 517.180 585.244 68.064 1
15 559.205 627.266 68.061 1
16 713.328 781.374 68.046 1
17 765.341 833.408 68.068 1
18 777.363 845.422 68.059 1
19 799.351 867.417 68.066 1
20 815.341 883.404 68.063 1
21 821.341 889.402 68.061 1
22 864.424 932.471 68.047 1
23 910.428 978.458 68.031 1
24 921.453 989.523 68.069 1
25 928.422 996.486 68.064 1
26 940.452 1 008.470 68.026 1
27 992.494 1 060.550 68.056 1
28 1 041.518 1 109.580 68.071 1
29 1 049.587 1 117.515 67.928 1
30 1 063.511 1 131.580 68.076 1
31 1 079.487 1 147.560 68.081 1
32 1 085.519 1 153.520 68.010 1
33 1 150.572 1 218.580 68.009 1
34 1 174.575 1 242.592 68.017 1
35 1 177.580 1 245.650 68.072 1
36 1 188.580 1 256.640 68.065 1
37 1 197.631 1 265.680 68.055 1
38 1 204.609 1 272.610 68.008 1
39 1 210.610 1 278.590 67.981 1
40 1 226.607 1 294.610 68.006 1
41 1 249.618 1 317.620 68.008 1
42 713.328 849.390 136.063 2
43 921.453 1 057.520 136.070 2
44 1 049.587 1 185.590 136.008 2
45 1 125.593 1 261.630 136.046 2
  从表1可以看出,经过处理后,相对分子质量相同的肽段有9个,相对分子质量差异约为68.07的肽段有32个,相对分子质量差异约为136.14的有4个。因此,制备的巯基肽中有9个肽段是非巯基肽,32个肽段是含有1个巯基的巯基肽,4个肽段是含有2个巯基的巯基肽。45个肽段中有36个肽段含有巯基,说明Thiopropyl-Sephrose 6B凝胶对巯基肽有很强的专一性。
3 结 论
     采用DTT还原-Thiolpropyl-Sepharose 6B共价色谱联用的方法成功制备了大豆球蛋白酶解物中的巯基肽。还原剂的最佳用量为20 mmol/L DTT。还原之后酶解物中的游离巯基含量提高了62.2倍。还原酶解物的最佳上样量为酶解物中巯基含量占凝胶活性位点的80%,最佳键合时间为30 min。解吸DTT最优浓度为20 mmol/L,最优时间为20 min。C18柱可以有效地将巯基肽中的DTT和2-巯基吡啶去除。Thiolpropyl-Sepharose 6B共价色谱对巯基肽有很高的选择性,45个肽段中有36个肽段含有巯基。
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