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油脂工艺
琥珀酰化改性花生蛋白研究
 
所属分类:油脂工艺   阅读:1341   日期:2017-09-12
字号:
 
摘要:为考察琥珀酰化改性因素对花生蛋白改性效果及结构性质的影响,采用单因素试验、响应面试验分析花生蛋白质量浓度、琥珀酸酐添加量、反应温度对改性花生蛋白酰化度与产率的影响,确定最优琥珀酰化改性条件。通过红外光谱、电子显微镜、氮溶解指数评价琥珀酰化改性花生蛋白的结构性质。结果表明:花生蛋白质量浓度、琥珀酸酐添加量是显著影响因素;最佳改性条件为花生蛋白质量浓度58.5g/L、琥珀酸酐添加量为花生蛋白质量的19.55%、反应温度49℃,在最佳条件下改性花生蛋白酰化度与产率分别为(82.82±0.59)%和(76.89±0.74)%;引入琥珀酰基改变了花生蛋白的分子结构,使蛋白质分子由折叠趋向伸展,蛋白质聚集体尺寸减小;改性花生蛋白的溶解性得到明显改善。

作者:芦鑫1,2,王克琴3,张丽霞1,2,宋国辉1,2,孙强1,2,黄纪念1,2

(1.河南省农业科学院农副产品加工研究中心,郑州450002;2.河南省农产品生物活性物质

工程技术研究中心,郑州450002;3.河南农业大学食品科学技术学院,郑州450002)

摘要:为考察琥珀酰化改性因素对花生蛋白改性效果及结构性质的影响,采用单因素试验、响应面试验分析花生蛋白质量浓度、琥珀酸酐添加量、反应温度对改性花生蛋白酰化度与产率的影响,确定最优琥珀酰化改性条件。通过红外光谱、电子显微镜、氮溶解指数评价琥珀酰化改性花生蛋白的结构性质。结果表明:花生蛋白质量浓度、琥珀酸酐添加量是显著影响因素;最佳改性条件为花生蛋白质量浓度58.5g/L、琥珀酸酐添加量为花生蛋白质量的19.55%、反应温度49℃,在最佳条件下改性花生蛋白酰化度与产率分别为(82.82±0.59)%和(76.89±0.74)%;引入琥珀酰基改变了花生蛋白的分子结构,使蛋白质分子由折叠趋向伸展,蛋白质聚集体尺寸减小;改性花生蛋白的溶解性得到明显改善。

关键词:花生蛋白;酰化度;二级结构;氮溶解指数

中图分类号:TS229;TQ936.2文献标识码:A

文章编号:1003-7969(2017)05-0034-06

Modificationofpeanutproteinbysuccinylation

LUXin1,2,WANGKeqin3,ZHANGLixia1,2,SONGGuohui1,2,

SUNQiang1,2,HUANGJinian1,2

(1.ResearchCenterofAgriculturalandSidelineProductsProcessing,HenanAcademyofAgriculturalSciences,

Zhengzhou450002,China;2.HenanEngineeringResearchCenterofBioactiveSubstancesin

AgriculturalProducts,Zhengzhou450002,China;3.CollegeofFoodScienceandTechnology,

HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou450002,China)

Abstract:Inordertoinvestigatetheimpactsofsuccinylationmodificationfactorsonmodificationeffectandstructureofpeanutprotein,theeffectsofmassconcentrationofpeanutprotein,dosageofsuccinicanhydrideandreactiontemperatureonacylationdegreeandyieldofthemodifiedpeanutproteinwereanalyzedbysinglefactorexperimentandresponsesurfacemethodology,andtheoptimalconditionsofmodificationbysuccinylationweredetermined.Thestructuralpropertiesofmodifiedpeanutproteinbysuccinylationwereevaluatedbyinfraredspectra,electronicmicroscopeandnitrogensolubilityindex.Theresultsshowedthatthemassconcentrationofpeanutproteinanddosageofsuccinicanhydrideweresignificantfactors.Theoptimalmodificationconditionswereobtainedasfollows:massconcentrationofpeanutprotein58.5g/L,dosageofsuccinicanhydride19.55%ofpeanutproteinmassandreactiontemperature49℃.Undertheseconditions,theacylationdegreeandyieldofthemodifiedpeanutproteinreached(82.82±0.59)%and(76.89±0.74)%respectively.Becauseoftheintroductionofsuccinylgroup,themolecularstructureofpeanutproteinchanged,sothatthefoldstateinclinedtoextensionandthesizeofproteinaggregateshrank.Thesolubilityofmodifiedpeanutproteinwasalsoimprovednotably.

Keywords:peanutprotein;acylationdegree;secondarystructure;nitrogensolubilityindex

 

  花生是世界重要的油料作物之一,年产量4600万t左右。我国是花生的生产大国,产量居世界第一,2015年花生产量为1700万t。花生蛋白是花生的主要组分,约占20%,由于花生蛋白的氨基酸组成均衡合理,营养价值高,适合人们消费,已经成为世界第三大食用植物蛋白资源[1-2]。

 

  虽然花生蛋白已经被广泛应用于食品领域,但同其他植物蛋白类似,花生蛋白在酸性、中性条件下溶解性差,易产生沉淀,影响产品品质,限制其使用范围[3-5]。研究表明:酰化改性可以有效提高蛋白质分散性与溶解性[6-7]。Beuchat[8]通过琥珀酰化改性花生蛋白粉,提高其在pH6~7的溶解性、持水力、乳化性;Monteiro等[9]发现花生蛋白的主要成分花生球蛋白、伴花生球蛋白Ⅰ和伴花生球蛋白Ⅱ都可以采用琥珀酰化改性,将其等电点降低到4以下,改善其溶解性和分散性。

 

  目前国外开展了琥珀酰化改性花生蛋白的研究工作,但国内该领域研究仍处于起步阶段。本文以改性花生蛋白酰化度和产率为评价指标,考察花生蛋白质量浓度、琥珀酸酐添加量、反应温度对花生蛋白琥珀酰化改性的影响,建立最佳的琥珀酰化改性工艺,并对比改性前后蛋白质的功能性质与结构的差异,为琥珀酰化改性花生蛋白的后续研究提供参考。

 

  1材料与方法

  1.1试验材料

 

  花生蛋白粉:实验室自制,具体条件见文献[10]。丁二酸酐(琥珀酸酐),上海阿拉丁试剂有限公司;茚三酮,瑞金特化学有限公司;其他试剂均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

 

  K-05全自动凯氏定氮仪,UV-6300型分光光度计,IS5型傅里叶红外分析仪,LyovacGT1冷冻干燥机,DL-5-B离心机,XS205电子天平,DF-101S集热式磁力搅拌器。

 

  1.2试验方法

  1.2.1琥珀酰化改性花生蛋白

 

  配制一定质量浓度的花生蛋白溶液,在一定温度下,逐步加入琥珀酸酐,搅拌反应1h,整个过程中使用3mol/LNaOH溶液维持反应体系pH在8.0~8.5之间。反应结束后,用3mol/L盐酸中和,以5000r/min离心15min,收集上清液,采用截留相对分子质量为3500Da透析袋透析12h,冷冻干燥获得改性花生蛋白。

 

  1.2.2改性花生蛋白酰化度的测定

 

  参考刘金阳等[11]的方法。取0.4mL1.2.1中离心上清液,加入0.4mL蒸馏水,随后加入0.1mol/L、pH8.0的磷酸盐缓冲液及茚三酮溶液各0.2mL,混合均匀后100℃水浴加热15min,反应结束后,迅速冷却至室温并加蒸馏水定容至5mL,静置15min后,以蒸馏水作为空白,测定在570nm处的吸光度Am。取相同质量浓度的花生蛋白溶液0.4mL,按照上述步骤处理,测定吸光度A0。按照下式计算酰化度:

酰化度=(1-Am/A0)×100%

 

  1.2.3改性花生蛋白产率的计算

 

  分别采用凯氏定氮法(GB5009.5—2010,系数为5.46)测定花生蛋白与改性花生蛋白的蛋白质含量C0和Cm,采用下式计算改性花生蛋白产率:

改性花生蛋白产率=Mm×Cm/M0×C0×100%

式中:M0和Mm分别为改性前后花生蛋白的质量。

 

  1.2.4花生蛋白的红外光谱分析

 

  将干燥的花生蛋白与琥珀酰化改性花生蛋白分别与溴化钾按1∶100的比例充分研磨,用粉末压片机以15MPa压制30s,将压片转移到红外分析仪中扫描。扫描范围为4000~400cm-1,采样64次,以空气为背景,样品扫描前扣除背景。采用Origin8.5计算蛋白质二级结构中ɑ-螺旋、β-折叠、β-转角、无规则卷曲所占的比例[12]。

 

  1.2.5花生蛋白的微观结构分析

 

  花生蛋白与琥珀酰化改性花生蛋白干燥后,用离子喷溅仪进行真空喷金,随后在15kV的加速电压下,电子显微镜拍摄,照片分辨率600DPI[13]。

 

  1.2.6花生蛋白氮溶解指数的测定

 

  分别称取1g样品,溶于50mL纯水中,调节pH4、6、8缓慢搅拌30min后,在4000r/min离心30min,取上清液5mL。凯氏定氮法测定上清液中可溶性氮质量Ms与样品总氮质量Mt,然后按下式计算氮溶解指数(NSI)[14]:

  NSI=Ms/Mt×100%

 

  1.2.7数据处理

 

  采用软件SAS9.2进行Box-Behnken设计的响应面分析,以Duncan算法进行单因素方差分析。图中同一曲线上带有相同小写字母的样品间在0?05水平上无显著差异。

 

  2结果与分析

  2.1花生蛋白琥珀酰化改性单因素试验

 

  2.1.1花生蛋白质量浓度对花生蛋白琥珀酰化改性的影响

 

  分别配制质量浓度为30、60、90、120、150、180g/L的花生蛋白溶液,琥珀酸酐添加量为花生蛋白质量的10%,在温度30℃、pH8.0~8.5下反应1h后,离心,取上清液测定酰化度与产率,结果见图1。

  改性效果的影响

 

  由图1可知,随着花生蛋白质量浓度的增加,酰化度呈现先小幅上升后显著下降的趋势,这是由于当花生蛋白质量浓度增加时,单位体积溶液中可参与反应的蛋白质分子数目增加,与琥珀酸酐碰撞概率增加,加快了反应速度。当花生蛋白分子持续增加时,由于琥珀酸酐的浓度一定,使得两种分子碰撞概率减少,蛋白质之间相互碰撞概率提高,导致酰化度降低。以上结果与李磊等[15]对琥珀酰化改性大豆蛋白的结果一致。

 

  由图1可知,改性花生蛋白产率随着花生蛋白质量浓度的增加呈现先小幅上升后显著下降降趋势,这是因为随着酰化度降低,琥珀酰化改性效果降低,对其溶解性的改善作用减弱,导致中性条件下,溶解在上清液中的蛋白质减少,导致产率降低。综合酰化度与产率,花生蛋白质量浓度以60g/L为宜。

 

  2.1.2琥珀酸酐添加量对花生蛋白琥珀酰化改性的影响

 

  配制质量浓度为60g/L花生蛋白溶液,分别添加花生蛋白质量的5%、10%、15%、20%、25%、30%的琥珀酸酐,在温度30℃、pH8.0~8.5下反应1h后,离心,取上清液测定酰化度与产率,结果见图2。

  由图2可知,随着琥珀酸酐添加量从5%增加到10%,改性花生蛋白酰化度显著增加,琥珀酸酐添加量继续增加到25%的过程中,改性花生蛋白酰化度虽然持续增加,但增加幅度减弱,当琥珀酸酐添加量增加到30%,酰化度反而下降。产生以上变化的原因是:琥珀酸酐添加量增加提高了与蛋白质分子的碰撞概率,从而提高酰化度;当琥珀酸酐添加量过高时,部分琥珀酸酐与水反应,导致未能有效提高酰化度[7]。

 

  由图2可知,改性花生蛋白产率随着琥珀酸酐添加量的增加而增加,但是当琥珀酸酐添加量从25%增加到30%时,改性花生蛋白产率下降,这是受酰化度下降,蛋白质溶解性削弱,降低改性花生蛋白产率。考虑生产成本与污水处理,琥珀酸酐添加量以15%为宜。此时,改性花生蛋白酰化度与产率分别为(76.24±0.64)%和(69.22±0?60)%。

 

  改性效果的影响

  2.1.3反应温度对花生蛋白琥珀酰化改性的影响

 

  配制质量浓度为60g/L的花生蛋白溶液,琥珀酸酐添加量为花生蛋白质量的15%,分别在25、30、35、40、45、50、55、60℃下,pH8.0~8.5反应1h后,离心,取上清液测定酰化度与产率,结果见图3。

 

  反应温度是影响琥珀酰化改性的重要因素,低反应温度会导致分子运动速度减慢,从而降低蛋白质分子与琥珀酸酐的碰撞概率,降低反应速度,并且蛋白质分子在较低温度下,分子结构未充分伸展,不利于活性中心暴露,也会降低花生蛋白改性效率;高反应温度虽然可以加速分子运动速度,提高蛋白质分子与琥珀酸酐碰撞概率,加速改性反应,但高反应温度也会加快琥珀酸酐与水产生羧酸的副反应速度,同时蛋白质在高温时会发生聚集、变性,这都会导致体系内参与改性反应的底物浓度的降低,进而影响改性效果。

 

  由图3可知,反应温度对花生蛋白改性的影响符合上述规律,当反应温度从25℃升高到50℃时,酰化度显著增加,但继续升高反应温度后,酰化度反而下降。与酰化度变化趋势相似,随着反应温度升高,琥珀酰化改性花生蛋白产率呈现先上升后下降的趋势。这是由于琥珀酰化改性花生蛋白的溶解性与酰化度密切相关,高酰化度的改性花生蛋白具有良好的溶解性,从而增加中性条件下上清液中蛋白质浓度,最终提高琥珀酰化改性花生蛋白产率。结合酰化度与产率,反应温度采用50℃为宜,在此条件下,改性花生蛋白的酰化度与产率分别为(82.20±0.56)%和(75.59±0.66)%。

 

  2.2花生蛋白琥珀酰化改性响应面试验

 

  在上述单因素试验的基础上为了分析单因素间的交互作用,以获得最佳的花生蛋白改性条件,采用响应面试验优化,具体试验设计与结果见表1,方差分析见表2、表3。

  采用SAS分析表1中数据,分析以花生蛋白质量浓度、琥珀酸酐添加量、反应温度为自变量,酰化度为因变量的回归模型发现(见表2),该模型高度显著(P<0.01),且失拟项P=0.12>0.05,这表明该模型能够客观反映改性因素对酰化度影响的规律。同时,R2为98.52%,R2Adj为95.85%,这说明回归模型的回归方程能够准确测算酰化度变化趋势,并用于确立最佳改性工艺。获得回归方程为:y1=-257+14.34x1+2.14x2+11.33x3-1.17x21+0.08x1x2-0.04x1x3-0.07x22-0.39×10-2x2x3-0.11x23。

  由表2可知,在响应面考察的因素变化范围中,花生蛋白质量浓度和琥珀酸酐添加量是高度显著因素(P<0.01),且花生蛋白质量浓度的影响大于琥珀酸酐添加量,而反应温度是不显著影响因素(P>0?05);同时,因素间的交互作用不显著。

 

  由表3可知,模型高度显著(P<0.01),且失拟项P>0.05,这表明该模型能够客观反映改性因素与产率的关系。另外,R2为97.54%,R2Adj为93.11%,这说明回归模型的拟合曲线能够预测产率,并科学确立最佳改性工艺。获得回归方程为:y2=-315.21+16.43x1+1.50x2+13.40x3-1.43x21+0.11x1x2-0.04x1x3-0.05x22-0.17×10-2x2x3-0.14x23。

 

  分析影响因素的显著性发现,花生蛋白质量浓度是高度显著因素(P<0.01),琥珀酸酐添加量是显著因素(P<0.05),而反应温度是不显著影响因素(P>0.05),因素间的交互作用不显著。

 

  由SAS预测,当花生蛋白质量浓度58.2g/L、琥珀酸酐添加量为花生蛋白质量的18.04%、反应温度49?23℃时,获得最高酰化度,即(82.98±0?67)%;当花生蛋白质量浓度58.3g/L、琥珀酸酐添加量为花生蛋白质量的19.55%、反应温度49.17℃时,获得最高产率,即(76.89±1.17)%。为获得最高的产率,并结合实际生产条件,将花生蛋白琥珀酰化改性的最佳条件调整为:花生蛋白质量浓度58.5g/L,琥珀酸酐添加量为花生蛋白质量的19.55%,反应温度49℃。在最佳条件下改性花生蛋白酰化度与产率分别为(82.82±0.59)%和(76?89±0.74)%。

 

  2.3琥珀酰化改性花生蛋白的性质

  2.3.1改性花生蛋白的红外光谱

 

  为分析琥珀酰化改性对花生蛋白结构的影响,采用红外光谱分析琥珀酰化改性花生蛋白与未改性花生蛋白的差异,结果见图4。

  由图4可知,两种花生蛋白的红外光谱基本相似,在3300~3400cm-1有N—H伸缩振动产生的吸收峰,在1260~1300、1530~1550、1600~1700cm-1有蛋白质特征吸收谱带酰胺Ⅲ、Ⅱ(N—H变形振动、C—N伸缩振动)、Ⅰ(CO)产生的吸收峰。但由于琥珀酰化改性将琥珀酸酐引入,改性花生蛋白的红外光谱图在806.8、1028.3、1081.2cm-1处产生新的吸收峰[16]。

 

  为分析改性对花生蛋白二级结构的影响,采用Origin8.5中峰型拟合工具分析1600~1700cm-1的透光率,计算花生蛋白二级结构组成,结果见表4。

 

  由表4可知,通过琥珀酰化改性可以减少花生蛋白中β-折叠与β-转角结构,增加α-螺旋与无规则卷曲,原因可能是由于带负电的琥珀酰基取代带正电的铵离子,从而使蛋白质分子内带负电的羰基与带正电的氨基间的引力变为斥力,导致蛋白质分子从原有的折叠弯曲结构变为伸展状态。

 

  2.3.2改性花生蛋白的微观结构

 

  为考察改性对花生蛋白微观形态的影响,采用扫描电镜观察花生蛋白与琥珀酰化改性花生蛋白的微观结构,结果见图5。

 

  由图5可知,花生蛋白聚集成球状或团状,其表面光滑;而琥珀酰化改性花生蛋白呈现片状,且聚集物尺寸要小于普通花生蛋白形成的聚集物。两种蛋白质微观形态的差异可能是由于蛋白质分子结构发生变化,引发蛋白质微观聚集形态产生差别。

 

  2.3.3改性花生蛋白的氮溶解指数

 

  为评价琥珀酰化改性对花生蛋白溶解性提高效果,测试不同pH条件下,花生蛋白与琥珀酰化改性花生蛋白的NSI,结果见表5。

 

  由表5可知,在pH4、6、8下,琥珀酰化改性花生蛋白的NSI明显高于花生蛋白的,这表明琥珀酰化改性可以提高花生蛋白的溶解性,以上结果与琥珀酰化改性提高米糠蛋白、大豆蛋白溶解性的结果一致[17-18]。因为琥珀酰化减弱了由于蛋白质分子中氨基和羰基之间的引力使蛋白质分子集聚的程度,这有利于蛋白质分子与水分子发生水合,促进在水中分散、溶解。蛋白质中净负电荷的增加推动蛋白质等电点向低pH移动,从而改善在酸性条件下的溶解性。

 

  3结论

 

  以改性花生蛋白酰化度与产率为评价指标,通过单因素试验、响应面优化试验考察花生蛋白质量浓度、琥珀酸酐添加量、反应温度对琥珀酰化改性花生蛋白的影响,并建立最佳改性工艺条件。另外,采用红外光谱、电子显微镜与氮溶解指数分析改性前后花生蛋白结构性质差异。结果表明:花生蛋白琥珀酰化改性的最佳条件为花生蛋白质量浓度58.5g/L、琥珀酸酐添加量为花生蛋白质量的19.55%、反应温度49℃,在最佳条件下改性花生蛋白酰化度与产率分别为(82.82±0.59)%和(76.89±0.74)%。通过琥珀酰化改性,花生蛋白结构与形态发生变化,分子结构由折叠趋向伸展,蛋白质聚集物尺寸减小;花生蛋白的溶解性提高,尤其在酸性条件下,溶解性改善明显。

 

参考文献:

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阅读:1341   来源:   编辑:中国油脂网编辑
 
关键词:花生蛋白
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