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L-α-甘油磷脂酰胆碱的制备、纯化及检测研究进展

发布日期:2017-10-25 中国油脂网

 康世宗1,张海臣2,吴永辉3,谷克仁1,2
 
(1.河南工业大学化学化工学院,郑州450001;2.吉林工程职业学院,吉林四平136001;
 
3.广州倚德生物科技有限公司,广州511340)
 
摘要:L-α-甘油磷脂酰胆碱(L-α-GPC)是动物体内天然存在的水溶性磷脂代谢产物,是乙酰胆碱合成的胆碱源。甘油磷脂酰胆碱能够有效增强人体的记忆力和认知能力,预防和治疗多种疾病。然而国内L-α-GPC的制备、纯化和检测技术相对不够成熟,较难满足市场对高质量、高纯度L-α-GPC的需求。通过对国内外L-α-GPC的制备、纯化及检测方法进行综述,进一步为甘油磷脂酰胆碱以及相关产品开发技术提供支持。
 
关键词:L-α-甘油磷脂酰胆碱;制备;纯化;检测
 
中图分类号:Q545;TQ645.9文献标识码:A
 
文章编号:1003-7969(2017)08-0103-05

Advance in preparation, purification and detection of 
L-α-glycerylphosphorylcholine
KANG Shizong1, ZHANG Haichen2, WU Yonghui3, GU Keren1,2
(1.College of Chemistry and Chemical Engineering, Henan University of Technology, Zhengzhou 450001, China;
2.Jilin Engineering Vocational College, Siping 136001, Jilin, China;
3.Guangzhou Yide Biological Technology Co., Ltd., Guangzhou 511340, China)
 
 
Abstract:L-α-glycerophosphorylcholine (L-α-GPC) is a type of water-soluble phospholipid metabolite, which naturally exists in the animal body, and it is also the choline source of preparing the acetylcholine. It can not only enhance the peoples memory and cognitive abilities, but also prevent and treat lots of diseases. It will be difficult to meet the market demand of high-quality and high-purity L-α-GPC without the mature technology of preparation, purification and detection. The methods of preparation, purification and detection of L-α-GPC at home and abroad were summarized, in order to provide support to the development of L-α-GPC and related products.
Key words:L-α-glycerophosphorylcholine; preparation; purification; detection

L-α-甘油磷脂酰胆碱(L-α-GPC)又称甘油磷酸胆碱、甘磷酸胆碱,是动物体内天然存在的水溶性磷脂代谢产物,经口服后,能到达胆碱突触末梢并增加乙酰胆碱的合成和释放[1-2]。L-α-GPC不仅可以作为保健品,促进大脑中乙酰胆碱和磷脂酰胆碱的生物合成,提高人的记忆能力和认知能力,也能有效治疗老年痴呆类疾病如阿尔茨海默病,被医药界称为“大脑的防衰老营养素”[3-4]。L-α-GPC还可以保护肝脏,抵抗高脂蛋白的脂肪渗透,起到抗类风湿、抗高血脂和抗动脉硬化的作用。另外L-α-GPC在一定程度上能够增强人体肌肉力量,提高反应敏捷度[5]。
 
国外对L-α-GPC的研究始于20世纪三四十年代,国内对该产品的研究起步较晚,在质量、规模方面与国外产品相比均存在一定的差距。纯度较低的L-α-GPC中可能含有部分色素和非极性杂质,常温常压下性质不稳定,不仅药理作用弱,还有可能产生对人体有害的毒素[6-7]。国内药用L-α-GPC几乎全部依靠进口,95%以上的高纯度L-α-GPC价格非常昂贵[8-9]。因此,研究和开发高纯度L-α-GPC的生产工艺,扩大生产规模以满足市场对L-α-GPC的需求,具有重要意义。
 
1L-α-GPC的制备方法
 
由于天然存在的L-α-GPC极少,直接从牛乳或者胰脏中提取比较困难,目前国内外制备L-α-GPC方法主要有化学醇(水)解法、非水相酶法、低沸点有机胺催化法和化学合成法[10],整体上可总结为催化水解法和化学合成法。
 
1.1催化水解法
 
目前,磷脂酰胆碱(PC)催化水解的方法有非水相或水相中用生物酶、金属钠、甲醇钠、乙醇钠、有机胺等催化醇解。磷脂酰胆碱上两个脂肪酰基(见图1中虚线标注部分)被水解,断开1、2位上的酯键就可以得到甘油磷脂酰胆碱。甘油磷脂酰胆碱含有一个季铵盐正电荷和一个磷酸负电荷,其分子结构式如图2所示。
 
 
 
阮朝滨等[11]利用碱金属醇盐作为催化剂,产品为白色固体L-α-GPC结晶,收率达到72.2%。刘磊[12]以碱金属硅酸盐固体碱作为催化剂,在最佳反应条件下使大豆磷脂酰胆碱和甲醇发生酯交换反应制备L-α-GPC,收率达到95.1%。Li等[13-15]探索了丙胺、叔丁胺作为催化剂,磷脂酰胆碱的转化率均可达到98%以上;并对以氢氧化四丁基铵为催化剂的反应进行动力学分析,构建动力学模型,提出该反应可视为准一级反应,反应活化能为21.98kJ/mol[16]。
 
相比其他催化剂,生物酶技术作为一种安全、绿色、高效的催化技术为L-α-GPC的工业化生产开辟一条全新的道路。磷脂酶A1(PLA1)是一类催化磷脂sn-1位酰基催化水解的酶族[17]。其作用机理为:第一步,PC的sn-1位的脂肪酸酰基被水解,生成sn-2-溶血磷脂酰胆碱(sn-2-LPC);第二步,经过自动酰基转移,sn-2-LPC转化为sn-1-LPC;第三步,磷脂酶A1再作用于sn-1-LPC中sn-1的脂肪酸酰基得到L-α-GPC。
 
利用以上原理,Chang等[18]以磷脂酶A1催化水解大豆磷脂酰胆碱,抑制了第二步的酰基转移,得到纯度为83.7%的溶血磷脂酰胆碱(LPC),并且产物中没有检测到L-α-GPC。El等[19]利用紫外分光法连续准确地测定磷脂酶A1、A2的作用位点和催化机理,并介绍了抑制酰基转移的方法。Bang等[20]以大豆磷脂酰胆碱为原料,在正己烷-水(体积比5.8∶1)双相体系中利用磷脂酶A1水解制备L-α-GPC,优化了反应温度、反应时间、载酶量等工艺参数,然后利用乙醚萃取与硅胶柱色谱纯化后得到了99.3%的高纯度L-α-GPC,该研究表明相对于单水相的酶催化体系,正己烷-水双相体系中L-α-GPC产率更高。可见溶剂的不同或界面的疏水性质有所差异,水解产物的产率也不同。
 
常规的单一酶解法制备L-α-GPC用磷脂酶A1作催化,进行酰基的自动转移。张文喆等[21-22]以复合磷脂酶法(磷脂酶A1+磷脂酶A2)制备L-α-GPC。这种方法虽然未能提高得率,但缩短了反应时间,相对提高了生产效率。周雯君等[23]以磷脂酶A1和磷脂酶A2为复合酶,在水相及非均相微乳体系下分别酶解制备L-α-GPC,得到了最佳工艺条件。Blasi等[24]在微乳体系中,碱性条件下使用磷脂酶A1、A2通过酶解脱酰基反应制备L-α-GPC,转化率较高。
 
1.2化学合成法
 
Puricelli[25]以D-亚异丙基甘油对甲苯磺酸酯为起始原料,与磷酸胆碱四甲基铵盐反应,一步制备L-α-GPC,收率达到75%。Song等[26]应用shapless环氧开环反应原理,用(R)-(+)缩合甘油与磷酸胆碱在异丙胺存在条件下通过亲核加成制备L-α-GPC。
 
李海林等[27]利用(R)-环氧氯丙烷与苄醇在强碱作用下缩合制备(S)-苄基缩水甘油醚,然后将(S)-苄基缩水甘油醚与氯化磷酸胆碱反应制得L-α-氯化甘油磷酸胆碱苄基醚;再将所得到的L-α-氯化甘油磷酸胆碱苄基醚通过Pd/C加氢反应脱去苄基保护基,最后纯化即得L-α-GPC。苏福男[28]利用一种氯化磷酰胆碱钙盐和(R)-(-)-3-氯-1,2-丙二醇为原料,通过膜分离除去氯化钠等杂质,最后经过离子交换树脂进行分离制备甘油磷脂酰胆碱,产品纯度可达到99.7%。艾海马等[29]以D-甘露糖醇为原料,经缩酮化、氧化、还原制得D-亚异丙基甘油,再与2-氯-2-氧-1,3,2-环氧磷戊烷进行酯化反应,然后用三甲胺进行氨化,最后水解除去丙叉基得目标化合物L-α-GPC,总收率从9.5%提高到38.6%(以D-甘露糖醇计)。
 
在以磷脂酰胆碱为原料利用合适的催化剂催化脱酰,再进行酰基转移制备L-α-GPC的工艺中,原料通常为磷脂酰胆碱,无毒无害,产物收率高。但是原料纯度要高,否则将会生成很多副产物,影响产品纯度并对后期的分离提纯造成困难,并且溶剂的回收耗能大,催化剂价格高。另外,水解过程中可能造成手性结构消旋,导致产品旋光度不合格。化学合成法制备L-α-GPC,产品纯度高,分离纯化容易,但是工艺复杂,操作条件苛刻,部分原料有毒,中间体不易得,对工业化生产造成一定影响。
 
2L-α-GPC的分离纯化方法
 
2.1传统方法
 
通过酯交换反应制备GPC工艺中,反应液中存在其他中性脂类以及脂肪酸甲酯等[30],同时由于原料中往往伴有磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)等杂质,所以水解产物中也含有甘油磷脂酰乙醇胺(GPE)、甘油磷脂酰丝氨酸(GPS)、甘油磷脂酰肌醇(GPI),与目标产物GPC的极性相似,利用简单的溶剂萃取[31]很难去除这些杂质。早期分离方法主要有沉淀法、重结晶法、溶剂萃取法。这些方法在纯化GPC时存在自身的优缺点:溶剂萃取法利于工业化大规模生产,但很难制备出高纯度的GPC,萃取过程需要消耗大量有机溶剂,溶剂的回收也将产生很高的能耗;沉淀法主要利用氯化汞等可溶性汞盐进行分离杂质,重金属离子的引入和残留对医药级GPC的开发是不符合要求的;重结晶法是将含有水的液态粗GPC用乙醇等溶剂溶解后,蒸发结晶提纯GPC,在工业化规模生产方面满足不了要求。以上方法对产品纯度和旋光性都达不到市场需求,无法商业化生产,现已逐渐被淘汰。
 
2.2柱色谱层析法
 
柱色谱层析法分为硅胶柱层析法、氧化铝柱层析法、离子交换树脂柱层析法,以及将两种填料进行联合层析法。离子交换树脂柱层析法操作简单,回收率高,可重复性使用,并能分离性质和结构相似的化学物质,如分离异构体,特别适用于L-α-GPG的纯化分离操作[32]。
 
Liu等[33]利用磷脂酶A1酶法水解,然后用离子交换树脂纯化和硅胶柱层析法制备纯度高达99.8%的L-α-GPC,最终收率高达78.4%。Zhang等[34]利用D001和D301-111阴离子交换树脂柱层析法纯化磷脂酶A1催化水解产物,利用活性炭进行脱色并去除小颗粒杂质,得到纯度高达98.8%的L-α-GPC。周丽等[35]采用以离子交换树脂为分离介质的柱层析法及活性炭脱色法,对粉末磷脂的醇解反应液进行分离纯化。通过筛选,确定了D001树脂为第一层析柱的分离介质,201×7树脂为第二层析柱的分离介质,然后利用D113柱对L-α-GPC粗溶液进一步纯化,最后经过旋转蒸发和真空干燥可得到纯度达97.1%的L-α-GPC,回收率为84.8%。
 
但离子交换树脂对L-α-GPC、GPE和LPC的分离度相对来说仍然不是很高,导致产品的回收率低,整个纯化周期长[36]。
 
3L-α-GPC的分析检测方法
 
3.1定性分析
 
对于油状的L-α-GPC,可利用传统的检测手段如红外光谱(IR)、核磁共振谱(1H-NMR,1H-1HCOSY,13C-NMR,13C-DEPT,13C-1HHSQC,13C-1HHMBC,31P-NMR)、质谱(ESI+离子源,220℃)、LC-MS、旋光度测定、薄层色谱等技术对L-α-GPC进行定性表征[37]。另外,在利用磷脂酶A1催化水解PC过程当中,Ca2+是必需的辅酶因子[38-39],需要除去,原子吸收光谱可以作为辅助手段对产品中Ca2+含量进行监测[37],为L-α-GPC生产过程中杂质控制提供依据。
 
然而对于晶体状态的L-α-GPC很难利用以上方法进行表征。Oh等[40]公开了一种制备Ⅰ、Ⅱ晶型L-α-GPC晶体的方法,并利用差示扫描量热仪(DSC)进行表征,Ⅰ晶型L-α-GPC初始温度147℃并在150℃有吸收峰,Ⅱ晶型初始温度为62℃并在66℃处有吸收峰;利用X射线衍射法(XRD)对产品进行定性分析,Ⅰ晶型L-α-GPC在衍射角为(9.8±0.2)°、(12.0±0.2)°、(14.3±0.2)°、(15.8±0.2)°、(19.6±0.2)°处有特征峰,Ⅱ晶型在衍射角为(10.3±0.2)°、(12.2±0.2)°、(13.4±0.2)°、(14.8±0.2)°、(20.6±0.2)°处有特征峰,确证了两种晶型结构。由于晶体状态的L-α-GPC相比传统的油状L-α-GPC纯度更高,同时该晶体吸湿性低,存储期间具有良好的稳定性,所以更易保存。
 
赵成磊[41]以油状甘油磷酸胆碱为原料,将过氧化铝层析柱后的L-α-GPC油状物粗品通过两步结晶法制备L-α-GPC单晶纯品,用CuKα(λ=1.54184×10-10m)光源收集(150±2)K温度下的X射线单晶衍射数据,在4.89°≤θ≤69.75°范围内收集4137个衍射点,其中2204个[R(int)=0.0126]独立点。X射线单晶衍射结果表明该化合物为正交晶系,对L-α-GPC晶型进行了补充,为今后的L-α-GPC在制剂中晶型的选择提供了参考。
 
3.2定量分析
 
高效液相色谱法是现今普遍采用的定性、定量分析L-α-GPC的方法。由于L-α-GPC在200~800nm全波长范围内没有紫外吸收峰,不能用紫外检测器对其检测,所以可以用HPLC-ELSD对其定性或者定量分析[42-43],但是该方法使用的流动相一般含有水,对硅胶色谱柱的柱效有一定的损害作用,造成检测结果稳定性差,并且PC、LPC、L-α-GPC吸水性强,进一步增加结果的误差。核磁共振氢谱法可以解决此问题,不但避免了样品中水分对检测结果的干扰,还可以分别选取化学位移δ=4.40~4.50、4.14~4.16、3.76~3.83处的信号峰作为PC、LPC和L-α-GPC的特征性质子峰,并根据质子峰相对面积与物质的量的对应关系计算三者的相对含量[44],为PC两步水解过程中检测L-α-GPC产率提供了一种简单快速的方法。
 
刘丹等[45]建立了一种非水电位滴定测定L-α-GPC含量的方法,采用高氯酸标准溶液对L-α-GPC样品进行电位滴定,然后利用二级微商法找到点位突跃点,确定电位滴定终点消耗的高氯酸标准溶液体积[46],从而得出L-α-GPC含量,实验精密度较高,并且不受溶液浑浊度影响,可以作为定量分析L-α-GPC的新方法。
 
通常定性和定量分析L-α-GPC可将多种方法联用,以提高检测的准确性和可信度。
 
4结束语
 
医药、食品、保健品等领域对磷脂及其改性产品L-α-GPC都具有很大的需求,并且在未来将有更大的市场。国内有关L-α-GPC的制备、纯化、检测技术不是十分成熟,所以研发适用于大规模生产L-α-GPC的新工艺,提高产品质量,探索简便、快速的检测方法具有重要意义。

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