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Lipozyme  CALB L固定化及催化合成EPA/DHA 甘油酯的研究

发布日期:2018-01-19 中国油脂网

刘向前1,李道明1,王卫飞2,杨 博3 ,王永华1
(1.华南理工大学 食品科学与工程学院,广州 510640; 2.华南理工大学 化学与化工学院,广州 510640; 
3.华南理工大学 生物科学与工程学院,广州 510006)

摘要:研究利用树脂对脂肪酶Lipozyme  CALB L进行固定化,然后将固定化酶用于催化富含二十二碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)的脂肪酸乙酯与甘油进行酯交换反应合成甘油酯。在17种常用树脂中,环氧树脂(ECR8285)在缓冲液pH 5、缓冲液离子浓度1 mol/L、酶加量120 mg/g(以载体质量计)时,通过共价结合固定化的Lipozyme  CALB L酶活力最高,可以达到22 967 U/g,蛋白质吸附率为91.88%。以ECR8285固定化的Lipozyme  CALB L催化富含EPA和DHA的脂肪酸乙酯与甘油反应合成甘油酯,在叔丁醇体系中催化PUFA乙酯与甘油反应8 h后,PUFA乙酯的转化率可以达到51.1%;将叔丁醇回收后,在真空状态下继续反应24 h,PUFA乙酯的转化率可以达到917%,产物中甘油三酯的含量可以达到70%以上。
关键词:固定化;Lipozyme  CALB L;环氧树脂;EPA/DHA甘油酯
中图分类号:TQ641;TS218     文献标识码:A

文章编号:1003-7969(2016)11-0021-06
 

Immobilization of Lipozyme  CALB L and its application in synthesis of
EPA/DHA-enriched glycerides
LIU Xiangqian1, LI Daoming 1, WANG Weifei2, YANG Bo3, WANG Yonghua1
(1. School of Food Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China;
2. School of Chemistry and Chemical Engineering, South China University of Technology,Guangzhou 
510640, China; 3.School of Bioscience and Bioengineering, South China University of Technology,
Guangzhou 510006, China)


Abstract:Lipozyme  CALB L was immobilized by resin and was employed to synthesize triglycerides by transesterification of glycerol and EPA/DHA-enriched ethyl esters. Among commonly used seventeen kinds of resins, epoxy resin ECR8285 immobilized Lipozyme  CALB L through covalent combination had the highest enzyme activity of 22 967 U/g, and its adsorption rate of protein was 91.88% under the conditions of buffer solution pH 5.0, ionic concentration of buffer solution 1 mol/L and dosage of enzyme 120 mg/g(based on the mass of carrier).Then ECR8285 immobilized Lipozyme  CALB L was applied to synthesize triglycerides by transesterification of glycerol and EPA/DHA-enriched ethyl esters, and the conversion rate of PUFA ethyl esters reached 51.1% after transesterification of PUFA ethyl esters and glycerol for 8 h in tert-butanol system. And the conversion rate of PUFA ethyl esters and the content of triglycerides in product reached 91.7% and above 70% respectively when the transesterification continued for 24 h under vacuum after tert-butanol being recovered.
Key words:immobilization; Lipozyme  CALB L; epoxy resin; EPA/DHA-enriched glycerides




  二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)是具有重要生理功能的天然脂肪酸,随着对其生理功能研究的深入和深加工技术的进步,EPA/DHA产品已经逐渐成为人们日常所需的膳食补充剂和功能性食品原料。目前,深海鱼油一般经过乙酯化后再利用分子蒸馏、尿素包合、高真空精馏等技术对EPA/DHA进行分离纯化,获得高纯度的EPA/DHA乙酯[1]。与EPA/DHA乙酯相比,甘油酯型的EPA/DHA产品具有更高的生物利用度和更好的加工及储存稳定性。因此,人们对工业化合成高纯度EPA/DHA甘油酯进行了大量的科学研究。
     脂肪酶是一种重要的生物催化剂,非常适用于多不饱和脂肪酸的深加工工艺。南极假丝酵母脂肪酶B(Lipozyme  CALB L) 对众多脂类物质都表现出较高的催化活性,是用途最为广泛的脂肪酶之一[2]。与其他常用脂肪酶相比,脂肪酶Lipozyme  CALB L对长链脂肪酸(C20以上的脂肪酸)具有更高的催化活力,适用于催化EPA/DHA乙酯转化为甘油酯。固定化脂肪酶可以实现油脂的非水相催化,避免EPA/DHA乙酯转化为甘油酯过程中的水解等副反应的发生[3]。目前,可供工业化应用的固定化Lipozyme CALB L有诺维信公司生物技术有限公司的Novozym 435和漂莱特公司的Calb Immo PlusTM。Novozym 435是将Lipozyme  CALB L固定化在大孔吸附树脂上,广泛应用于油脂加工和手性拆分领域[4]。Calb Immo PlusTM是将重组南极假丝酵母脂肪酶B(Recombinant Lipase B from Candida antarctica )吸附固定化在大孔吸附树脂ECR1030M(粒径范围300~700 μm)上,降低了固定化酶在机械搅拌时的破碎率[5]。脂肪酶的固定化方法和载体的特性对其活力和稳定性具有显著影响,研究不同材料固定化的Lipozyme  CALB L可以为拓展Lipozyme  CALB L的应用领域、提高其工业化使用效率提供科学依据。
     本研究利用共价结合的方式将Lipozyme CALB L固定化在含有环氧基团的树脂上,得到活力和稳定性更高的固定化酶,并对其催化EPA/DHA乙酯转化为甘油酯的性能进行了考察,为实现酶法制备PUFA甘油酯工业化生产提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 原料与试剂
     Lipozyme  CALB L(蛋白质质量浓度为8 mg/mL),购自丹麦诺维信(中国)生物技术有限公司。大孔吸附树脂XAD1180N、NKA-9、HPD400、YWD01G2、AB-8、DA-201、SA-1、HP20、XAD1180及离子交换树脂D380,均购自南开大学化工厂;大孔吸附树脂ECR1030、环氧树脂ECR8285为漂莱特有限公司赠送; 离子交换树脂WA30、FPA53、FPC3500、CAT600、CAT601,均购自西安电力树脂厂。PUFA乙酯由舟山新诺佳生物工程有限公司赠送;37种脂肪酸甲酯混合标准品(CAS no.113 47885-U)、甘油二酯(15%的1,2-DAG和85%的1,3-DAG,CAS no.25637-84-7)和甘油三酯(CAS no.122-32-7)标准品,均购于Sigma-Aldrich(中国)有限公司。正己烷,色谱纯;月桂酸、正丙醇,均为分析纯。
1.1.2 仪器与设备 
     BS201S Sartorius精密天平,ANKe TDL-40B 台式离心机, THZ-C恒温振荡器, Agilent6890气相色谱仪,Waters2414高效液相色谱仪,2XZ-2 型旋片真空泵,RE-52A 旋转蒸发器。
1.2 实验方法
1.2.1 树脂预处理
     以上树脂除ECR1030、ECR8285不需预处理外,其余均按以下步骤处理:以95%乙醇浸泡24 h,去离子水洗涤至不含乙醇;5%的HCl溶液浸泡2 h,去离子水洗至滤液呈中性;2%的NaOH溶液浸泡2 h,去离子水洗至滤液呈中性,4 ℃冰箱存放备用。
1.2.2 固定化酶载体的选择
     分别称取0.5 g XAD1180N、NKA-9、HPD400、YWD01G2、AB-8、DA-201、SA-1、HP20、XAD1180、WA30、FPA53、FPC3500、CAT600、CAT601、D380、ECR1030、ECR8285于25 mL三角瓶中,加入6.25 mL (50 mg酶蛋白)Lipozyme  CALB L和6.25 mL 磷酸盐缓冲液(离子浓度为0.1 mol/L, pH为7)。置于30 ℃恒温振荡器中以120 r/min振荡8 h后静置过滤分离固定化酶;测定上清液的蛋白质浓度,过滤得到的固定化酶用同种pH缓冲液冲洗至洗出液不含酶蛋白后,于真空干燥箱中40 ℃真空干燥8 h。干燥结束后,测定其酶活力,选取具有最高酶活力的固定化酶的载体进行下一步研究。
1.2.3 固定化条件的优化
     分别称取1.0 g ECR8285于25 mL三角瓶中,加入一定量Lipozyme  CALB L酶液,并加入等体积的缓冲液(缓冲液的离子浓度和pH 依据不同实验设计),置于30 ℃恒温振荡器中以120 r/min振荡8 h;固定化结束后,洗涤过滤得到的固定化酶,于真空干燥箱中40 ℃真空干燥8 h后,测定其酶活力。
1.2.4 蛋白质吸附率的测定
     蛋白质含量采用考马斯亮蓝法[6]测定。固定化酶蛋白质吸附率的计算公式如下:
     蛋白质吸附率=(X1-X2)/X1×100%

(1)
     式中:X1为吸附前酶液的蛋白质含量,mg;X2为吸附后酶液的蛋白质含量,mg。 
1.2.5 固定化酶酶活力的测定
     固定化酶酶活力的测定参照诺维信标准分析方法[7]进行。测定方法:将320 μL水、8 g月桂酸与2.4 g丙醇(摩尔比1∶ 1)加入50 mL锥形瓶中,置于恒温摇床(60 ℃,200 r/min)预热10 min后,加入30 mg固定化酶,恒温振荡反应5 min,取样25 μL。固定化酶酶活力(U/g)按下式计算:
     酶活力=N×C×1 000 000/(5×M)

(2)
     式中:N为初始加入的月桂酸摩尔数;C为月桂酸酯化率;5为反应时间, min;M为加入固定化酶的质量,g。
1.2.6 气相色谱检测条件
     利用气相色谱分析月桂酸酯化率。色谱条件:DIKMA CP-SIL 88 毛细管柱(60 m×250 μm×02 μm);升温程序为140 ℃保持5 min,以4 ℃/min升温至220 ℃保持17 min,进样口温度250 ℃;载气高纯氮气,恒压137.89 kPa;氢火焰离子化检测器;检测口温度280 ℃;氢气流量30 mL/min;空气流量350 mL/min;尾吹气流量42 mL/min;进样量1 μL;分流比50∶ 1。
1.2.7 叔丁醇为溶剂酶法合成PUFA甘油酯
     将一定量甘油与PUFA乙酯按摩尔比1∶ 3 置于250 mL 具塞三角瓶中,添加50 mL 叔丁醇溶解、混匀。在三角瓶中按底物质量添加一定量的脂肪酶,置于恒温振荡器中反应,转速为180 r/min,于不同的反应时间取样分析反应混合物组成,计算乙酯转化率。
1.2.8 真空条件下酶法合成PUFA甘油三酯
     在叔丁醇体系中PUFA乙酯和甘油反应一定时间后,脱除叔丁醇回收反应混合物。将回收的反应混合物置于250 mL具塞三角瓶中,置于一定温度的恒温水浴中在磁力搅拌及真空条件下继续反应。
1.2.9 反应混合物组成分析
     取一定量反应混合物,于3 000 r/min离心5 min,回收脂肪酶,并收集上清液,采用配备Waters 2695 型示差检测器的高效液相色谱仪对产物中甘油酯的组成进行分析。色谱条件:色谱柱,Luna 5u Silica(2) 100 A,250 mm×4.60 mm(Phenomenex);流动相,正己烷-异丙醇(体积比18∶ 1);流动相流速1.0 mL/min;柱温35 ℃; 样品经流动相稀释200倍,进样量20 μL;数据处理软件为Breeze工作站。乙酯转化率按下式计算:
     乙酯转化率=(ω0-ωt)ω0×100%

(3)
     式中:ωt为反应一段时间后底物混合物中PUFA乙酯的含量;ω0为底物混合物中PUFA乙酯的初始含量。
2 结果与讨论
2.1 Lipozyme  CALB L固定化载体的选择
     脂肪酶的固定化根据酶与载体的作用方式可分为吸附法、包埋法、交联法和共价结合法等。吸附法包括物理吸附法和离子吸附法,一直是经济上最具吸引力的固定化方法;包埋法因其制备难度大,且仅适合作用于小分子底物和产物的酶,从而限制了其在工业上的应用;交联法制备难度大,且往往存在底物和产物在反应体系中难以扩散的问题;共价结合法因其固定化得到的固定化酶操作稳定性好,近年来引起了人们广泛的关注。本研究选取了17种不同的大孔吸附树脂、离子交换树脂及环氧树脂对Lipozyme  CALB L进行固定化,探究了不同树脂对Lipozyme  CALB L固定化效果的影响。测定所得固定化酶酶活力、蛋白质吸附率,结果如表1所示。
 

表1 不同树脂对Lipozyme  CALB L固定化的影响

树脂名称 树脂类型 蛋白质吸附率/% 酶活力/(U/g)
XAD1180 非极性大孔吸附树脂 69.54 8 176
XAD1180N 非离子型大孔吸附树脂 67.95 8 102
NKA-9 非极性大孔吸附树脂 66.99 7 506
HPD400 大孔吸附树脂 29.05 3 868
YWD01G2 大孔吸附树脂 68.79 7 761
AB-8 非极性大孔吸附树脂 27.16 3 430
DA-201 极性大孔吸附树脂 62.32 4 217
SA-1 强极性大孔吸附树脂 63.54 8 022
HP20 大孔吸附树脂 58.69 5 256
ECR1030 大孔吸附树脂 61.08 8 739
ECR8285 环氧树脂 93.45 17 469
续表1
树脂名称 树脂类型 蛋白质吸附率/% 酶活力/(U/g)
D380 弱碱性阴离子交换树脂 18.87 320
WA30 弱碱性阴离子交换树脂 8.86 735
FPA53 阴离子交换树脂 3.97 327
FPC3500 酸性阳离子交换树脂 18.76 125
CAT600 强酸氢型阳离子交换树脂 23.09 141
CAT601 强酸氢型阳离子交换树脂 31.07 145
 
  由表1可知,不同树脂载体固定化Lipozyme  CALB L得到的固定化酶其蛋白质吸附率和酶活力有较大差异。10种大孔吸附树脂对蛋白质吸附率有较大差异,其蛋白质吸附率处于27.16%~6954%之间。树指载体的吸附能力与树指载体自身的孔径、比表面积和孔隙率有关。Monsan[8]研究表明当载体孔径是蛋白质分子直径的3~9倍时固定化酶吸附效率较高。10种大孔吸附树脂吸附得到的固定化酶酶活力处于3 430~8 739 U/g之间。其中,以ECR1030为载体固定化得到的固定化酶酶活力可达8 739 U/g,然而以AB-8和HPD400为载体固定化得到的固定化酶酶活力仅为3 500 U/g左右,以其他吸附树脂为载体固定化得到的固定化酶酶活力均在4 200~8 800 U/g。这是因为载体不同的极性、比表面积、粒径和孔隙率等因素会影响载体与酶蛋白之间的相互作用,从而影响酶蛋白的吸附率和固定化酶的酶活力。Alessandra等[5]研究吸附树脂粒径对固定化Lipozyme  CALB L酶活力的影响,结果表明当载体粒径为400 μm时,最有利于Lipozyme  CALB L的吸附且固定化Lipozyme  CALB L能表现出较高的酶活力。
     与此同时,由6种离子交换树脂固定化制备得到的固定化酶其蛋白质吸附率非常低,处于3.97%~31.07%之间。固定化得到的固定化酶酶活力也非常低,仅处于125~735 U/g之间。离子交换树脂主要是通过载体上的阴阳离子与酶蛋白分子的带电基团相互作用从而将蛋白质分子吸附在载体上。本研究中,离子交换树脂上的蛋白质吸附率不高,固定化酶酶活力较低,可能是由于在pH7的环境下,载体与酶蛋白分子的相互作用较弱,从而导致蛋白质吸附率和酶活力较低。
     然而,由ECR8285环氧树脂固定化Lipozyme  CALB L得到的固定化酶其蛋白质吸附率和酶活力均较高。蛋白质吸附率高达93.45%,酶活力高达17 469 U/g。环氧树脂主要是通过树脂上的环氧基团与酶蛋白分子的氨基或羧基等残基进行共价结合,从而将酶蛋白分子固定在载体上,所以通过这种方式制备的固定化酶一般具有较好的稳定性,使用过程中酶不易从载体上脱落。并且,通过共价结合方式固定化得到的固定化酶能较好地保持酶蛋白分子的原有构象,使酶维持在较高活性。尤其是当载体表面的环氧基团与酶分子发生共价结合时,可有效减少固定化酶催化过程中的传质阻力。因此,综合蛋白质吸附率、酶活力等因素考虑,选用ECR8285固定得到的固定化酶进行接下来的研究。
2.2 缓冲液pH对固定化Lipozyme  CALB L的影响
     缓冲液pH通过影响载体和酶蛋白分子相关基团的解离状态来影响载体和酶蛋白相关基团的带电性,从而影响载体与酶蛋白分子之间的相互作用。本研究以含有环氧基团的ECR8285为载体,考察不同pH的缓冲液对ECR8285固定化Lipozyme  CALB L酶活力的影响。分别称取1.0 g ECR8285于25 mL三角瓶中,加入12.5 mL(100 mg酶蛋白)Lipozyme  CALB L酶液后,再加入12.5 mL不同pH(4、5、6、7、8、9、10)的0.1 mol/L的缓冲液,进行固定化处理,结果如图1所示。
    

QQ截图20180119151735
    

图1 缓冲液pH对固定化Lipozyme  CALB L的影响
  由图1可知,固定化酶在0.1 mol/L不同pH的缓冲液中表现出不同的酶活力和蛋白质吸附率。pH 4~5,固定化酶的酶活力增大,超过pH 5后,固定化酶的酶活力逐渐降低,其中从pH 9~10时,固定化酶酶活力急剧降低。而在所选的固定化pH 4~10的范围内,缓冲液的pH对蛋白质吸附率影响较小。固定化酶的酶活力在pH 5时达到最大,为19 644 U/g,随着pH的逐步增大,固定化酶的酶活力逐步降低,在pH 10时,其酶活力仅为9 707 U/g。这可能是因为pH的改变影响了载体上的环氧基团与酶分子发生共价结合的基团类型,从而影响了固定化酶的酶活力。当pH偏酸性时,载体上的环氧基团易与酶分子上的羧基结合;当pH为中性或偏碱性时,载体上的环氧基易与酶蛋白分子的巯基结合;当pH大于9时,环氧基团易与酶分子上的氨基结合[9]。所以,在不同pH的缓冲液条件下对酶蛋白进行固定化,将得到不同酶分子构象的固定化脂肪酶,从而表现出不同的酶活力。因此,选择pH 5的柠檬酸盐缓冲液进行离子浓度对固定化Lipozyme  CALB L酶活力影响的考察。
2.3 缓冲液离子浓度对固定化Lipozyme  CALB L的影响
     缓冲液离子浓度会影响酶蛋白在环氧树脂上的结合方式,从而影响固定化酶的蛋白质吸附率和酶活力。本研究考察pH 5时不同柠檬酸盐缓冲液离子浓度对环氧树脂ECR8285固定化Lipozyme CALB L的影响。分别称取1.0 g ECR8285于25 mL三角瓶中,加入12.5 mL(100 mg酶蛋白)Lipozyme  CALB L酶液后,再加入12.5 mL pH 5的不同离子浓度(002、0.1、0.5、1 mol/L)的缓冲液,进行固定化处理,结果如图2所示。
    

QQ截图20180119151747
    

图2 缓冲液离子浓度对固定化Lipozyme  CALB L的影响
  由图2可知,固定化酶的蛋白质吸附率随着缓冲液离子浓度的增大而略有增加,而固定化酶的酶活力则随着缓冲液离子浓度的增大而逐步增大。固定化酶的酶活力从0.02 mol/L 时的18 950 U/g逐步增加至1 mol/L 时的21 718 U/g,这与Mladen等[10]报道的环氧树脂固定化脂肪酶的结果相一致。这是因为适当提高缓冲液的离子浓度有助于酶分子通过共价结合方式固定在载体上,此外,环氧树脂也呈现大孔、多孔状,提高缓冲液离子浓度能有效降低物理吸附固定化的程度[11]。但是过高的离子浓度会导致蛋白质沉淀、影响酶蛋白的活性。因此,选用缓冲液离子浓度为1 mol/L进行酶加量对固定化Lipozyme  CALB L酶活力影响的考察。
2.4 酶加量对固定化Lipozyme  CALB L的影响
     固定化过程中,酶加量会影响载体对酶蛋白的吸附,从而影响固定化过程中蛋白质吸附率和固定化酶的酶活力,固定化过程中酶与载体的比例合适时才能得到酶活力较高的固定化酶。本研究以环氧树脂ECR8285为载体,离子浓度1 mol/L、pH 5的柠檬酸盐缓冲液为吸附体系,考察酶加量对固定化酶的影响。分别称取1.0 g ECR8285于25 mL三角瓶中,酶加量分别为80、120、160、200、240 mg/g,再加入与酶液相同体积的pH 5、离子浓度为1 mol/L的缓冲液,进行固定化处理,结果如图3所示。
    

QQ截图20180119151756
    

图3 酶加量对固定化Lipozyme  CALB L的影响
  由图3可知,随着酶加量的增加,固定化酶酶活力逐渐增加。当酶加量为120 mg/g时,固定化酶酶活力为22 967 U/g。随着酶加量的继续增加,固定化酶酶活力由22 967 U/g(120 mg/g)缓慢增加至24 052 U/g (240 mg/g)。而蛋白质吸附率则随着酶加量的增加而逐渐降低。当酶加量为120 mg/g时,蛋白质吸附率为91.88%。随着酶加量的继续增加,蛋白质吸附率则由91.88%(120 mg/g)急剧降至59.87%(240 mg/g)。这是因为随着酶加量的逐步增加,环氧树脂上的功能基团环氧基逐渐被酶蛋白分子所饱和,蛋白质吸附率逐渐减小。与此同时,过高的蛋白质吸附率会增加固定化酶上酶蛋白分子的拥挤程度,从而限制固定化酶酶活力的发挥,所以固定化过程中只有酶加量适宜时,才能获得较高酶活力、较高蛋白质吸附率的固定化酶。本研究中,酶加量为120 mg/g时,固定化酶酶活力达到22 967 U/g,蛋白质吸附率高达91.88%。
2.5 固定化酶催化合成富含EPA/DHA甘油酯
     选用环氧树脂ECR8285固定化的Lipozyme CALB L和Novozym 435、CalB Immo PlusTM为催化剂,考察3种酶在催化甘油与PUFA乙酯酯交换合成PUFA甘油酯过程中对乙酯转化率的影响。反应在50 ℃恒温振荡器中进行,转速为180 r/min,底物甘油与PUFA乙酯的摩尔比为1∶ 3,以叔丁醇为溶剂,底物质量浓度为200 g/L,酶加量为底物质量的2%,结果如图4所示。
     由图4可知,Novozym 435、CalB Immo PlusTM和ECR8285固定化的Lipozyme  CALB L 3种固定化酶均可以催化PUFA乙酯与甘油进行酯交换反应,而且在反应24 h后基本达到平衡,此时PUFA乙酯的转化率分别为51.4%、50.1%和52.2%。同时,由于固定化酶酶活力具有较大差异,在起始阶段的反应速率和达到反应基本平衡所需的时间也不同。 ECR8285固定化的Lipozyme  CALB L固定化酶酶活力最高,在本反应体系中催化PUFA乙酯与甘油反应8 h后,PUFA乙酯的转化率既可以达到511%,并基本达到反应平衡。Novozym 435和CalB Immo PlusTM均需要12 h以上,PUFA乙酯的转化率才可以达到50%以上。
    

QQ截图20180119151809
    

图4 不同固定化脂肪酶对PUFA乙酯转化率的影响
  在叔丁醇中酯交换反应24 h后将反应混合物中的叔丁醇利用减压蒸馏回收,然后将反应混合物置于100 Pa的真空状态下,在50 ℃的恒温磁力搅拌器中继续反应24 h,结果如图5所示。
    

QQ截图20180119151819
    

图5 真空状态下固定化脂肪酶对PUFA乙酯转化率的影响
  由图5可知,真空状态下酯交换反应产生的乙醇可以被有效地脱除,促进酯交换反应平衡向生成甘油酯的方向移动,提高了PUFA乙酯的转化率。在真空条件下继续反应24 h后,Novozym 435、CalB Immo PlusTM和ECR8285固定化的Lipozyme  CALB L催化的反应体系中PUFA乙酯转化率分别可以达到87.6%、84.1%和91.7%;对酯交换反应产物的组成进行液相色谱分析发现甘油三酯的含量分别可以达到66.7%,65.9%和70.2%。这说明以环氧树脂ECR8285固定化的Lipozyme  CALB L在催化酯交换反应合成富含EPA/DHA的甘油酯的工艺中,有良好的应用潜力。
3 结 论
     本研究利用环氧树脂ECR8285对南极假丝酵母脂肪酶Lipozyme  CALB L进行固定化,在缓冲液pH为5、缓冲液离子浓度为1 mol/L、酶加量为120 mg/g(以载体质量计)时,固定化Lipozyme  CALB L的蛋白质吸附率高达91.88%,固定化酶酶活力达到22 967 U/g。将固定化酶用于催化富含EPA和DHA的脂肪酸乙酯与甘油进行酯交换反应合成甘油酯,在叔丁醇体系中ECR8285固定化的Lipozyme CALB L具有最大的催化速率,催化PUFA乙酯与甘油反应8 h即可基本达到反应平衡,PUFA乙酯的转化率可以达到51.1%;将叔丁醇回收后,在真空状态下继续反应24 h,以ECR8285固定化的Lipozyme CALB L催化体系中PUFA乙酯的转化率可以达到 91.7%,产物中甘油三酯的含量可以达到70%以上,为实现酶法制备富含EPA/DHA甘油酯的工业化生产提供了科学依据。
参考文献:
[1] 马永钧,杨博. 海洋鱼油深加工技术研究进展[J]. 中国油脂,2011,36(4):1-6.
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