您好,欢迎来到中国油脂网 !

登录| 注册| 我的订单| 我的购物车(0)| 帮助中心
微信公众号

029-88626849

一株高效油脂降解菌的分离鉴定及其性能研究

发布日期:2018-02-28 中国油脂网

 刘 婕,杨 博
(华南理工大学 生物科学与工程学院,广州 510006)


摘要:从餐馆隔油池废水中筛选分离得到一株能高效降解油脂的芽孢杆菌DK-1,经16S rDNA同源性序列分析,鉴定为解淀粉类芽孢杆菌,并进一步考察了菌株的生物量、油脂去除率、CODCr去除率及乳化活性等性能。实验结果表明,菌体的乳化指数为65%,在初始油脂质量浓度为5 g/L,CODCr为55 000 mg/L左右的模拟高含油有机废水中,该菌株能生长并快速降解油脂,在48 h内油脂去除率为97.3%,CODCr的去除率为91.9%。 
关键词:筛选;鉴定;解淀粉芽孢杆菌;去除率
中图分类号:TS22   文献标志码:A   文章编号:1003-7969(2010)01-0007-04

Isolation,identification and characteristics of a high effective oil-degrading
LIU Jie,YANG Bo
(School of Bioscience and Bioengineering,South China University of Technology,Guangzhou 510006, China)


Abstract:An oil-degrading Bacillus stain DK-1 was isolated from oil trap of one restaurant. By 16S rDNA sequence homology analysis, it was identified as Bacillus amyloliquefaciens. The characteristics of the strain such as biomass, oil-degrading ability, CODCr removal ability and activity of emulsification were tested. The results showed that in simulated high-oil organic wastewater where the initial oil mass concentration was 5 g /L,CODCr was about 55 000 mg/L, the strain could grow and quickly degrade oils and fats.The removal rate of oils and fats was 97.3%, and CODCr removal rate was 91.9% in 48 h. 
Key words:screening;identification;Bacillus amyloliquefaciens;removal rate

油脂是生活废水中引起环境污染的一个重要组成部分,未经处理直接排放的生活污水中的油脂与其他颗粒物质聚集起来可引起下水管道堵塞甚至破裂[1,2]。此外,排入水体的油脂漂浮在河水、湖泊等水面上造成水体溶氧不足,严重影响水体的生态环境。

目前用于油脂处理的方法有物理法、化学法和生物法,生物法因其处理效果好、成本低、无二次污染等优点逐步成为油脂废水处理的首选方法。故从自然界中筛选高效除油微生物并研究其降解工艺已成为目前油脂废水处理的热点[3-7]。

芽孢杆菌属因其可产生芽孢,对环境的耐受性大、抗逆性强、无致病性等优点,逐步成为治理环境污染的首选菌种。本文以芽孢杆菌的筛选鉴定为基础,初步探讨了所筛分到的芽孢杆菌菌株的性能,为菌株的实际应用提供理论指导。

1材料与方法

1.1菌种样品

取自餐馆隔油池废水。

1.2培养基

1.2.1LB培养基

蛋白胨10g/L,酵母膏5g/L,NaCl5g/L,培养基pH7.2,121℃灭菌20min。

1.2.2富集培养基

K2HPO43g/L,NaCl5g/L,MgSO4·7H2O1g/L,蛋白胨10g/L,酵母膏5g/L,大豆油质量浓度为10g/L,培养基pH7.2,121℃灭菌20min。

1.2.3驯化培养基

(NH4)2SO40.5g/L,K2HPO40.3g/L,NaCl0.5g/L,MgSO4·7H2O0.2g/L,大豆油质量浓度分别为0.25、0.5、1、2.5、5g/L,培养基pH7.2,121℃灭菌20min。

1.2.4选择性平板培养基

(NH4)2SO40.5g/L,K2HPO40.3g/L,NaCl0.5g/L,MgSO4·7H2O0.2g/L;大豆油质量浓度10g/L,pH7.2,琼脂20g/L。将上述溶液加入少许乳化剂于微波炉中加热至琼脂完全溶解后用均质机将油脂分散成很均匀的体系,待冷却至60℃左右时于超净台中倒入无菌平板中,冷却后用紫外灯照射灭菌30min以上备用。

1.2.5高含油有机废水培养基

K2HPO40.3g/L,NaCl0.5g/L,MgSO4·7H2O0.2g/L,蛋白胨5g/L,酵母膏2.5g/L;大豆油质量浓度为5g/L;pH7.2,121℃灭菌20min。

1.3菌种的分离纯化

量取一定量餐馆隔油池废水于80℃下放置15min之后接入富集培养基中,待培养液中油脂降解完之后再重新接入新鲜的富集培养基中,如此重复3次后再将其接入大豆油质量浓度依次升高的无机盐培养基中进行驯化。于37℃,200r/min,驯化5个周期,每周期5d。

驯化结束后,取一定量涂布于以大豆油为唯一碳源的选择培养基平板上。待菌落长出后,挑取生长旺盛单菌落点接入选择培养基平板上。培养48h后挑取透明圈稍大的菌落进行多次重复划线分离,直到得到纯菌种。纯化后的菌株贮存于4℃冰箱中备用。

1.4菌株16SrDNA鉴定

采用酚-氯仿-异戊醇法提取细菌DNA为PCR扩增的模板,应用Oligo5.0设计引物对,分别命名为P16sF1和P16sR1,该引物对可扩增出全长的16SrDNA序列,预期扩增片段大小为1.5~1.6kb:

P16sF1:AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT;

P16sB1:TACGGCTACCTTGTTACGACTCACCCC。

PCR程序为:94℃预变性5min;循环体采用94℃变性30s;50℃退火30s,72℃延伸1min30s,共30个循环;最后一次延伸10min,于4℃保存。PCR产物经2%的琼脂糖凝胶电泳验证后直接进行测序,测序结果应用Blast软件与Genebank上序列进行同源性的比较。

1.5菌体乳化活性的测定

用接种环从菌种斜面上挑取一定的菌体接种于LB培养基中,在37℃、200r/min摇床中振荡培养24h后于6000r/min冷冻离心10min后收集上清备用。然后在带刻度的磨口试管中,加入4mL大豆油和6mL上清,涡旋振荡器充分振荡2min,室温静置24h后测量乳化层高度,以乳化指数(Emulsificationindex)表示乳化物质的乳化活性,如乳化指数大于50%,则表示该乳化液稳定[8]。

乳化指数=乳化层高度/有机相总高度×100%

1.6模拟高含油废水中菌株性能的测定

用接种环从菌种斜面中接入少量菌体于LB培养基中培养10~12h后接种于1.2.5所述培养基中,该培养基初始大豆油质量浓度为5g/L,初始CODCr约为55000mg/L,每隔8h取样检测培养液中的菌体生物量,残油含量和CODCr的降解情况。

1.6.1菌体生物量的测定

菌体生物量的测定采用UV7200型分光光度计于600nm处测得的吸光度OD菌体表示,通过菌液所产生的OD菌液值减去油脂乳化产生的上清的OD上清值计算而得,即OD菌体=OD菌液-OD上清。

1.6.2残油含量的测定

残油含量的测定采用紫外分光光度法[9]

1.6.3CODCr值的测定

CODCr的测定参照国家标准GB11914-1989的重铬酸钾法。

2结果与讨论

2.1菌种分离纯化

从餐馆隔油池废水中经富集、驯化、分离、纯化后分离到一株油脂降解菌命名为DK-1。

2.2菌株16SrDNA鉴定结果

以所提取的基因组DNA为模板经PCR扩增后其产物的电泳图如图1。图1表明,PCR结束后经过琼脂糖凝胶电泳检测出了预期条带。扩增产物直接测序,所得结果运用Blast软件进行分析表明,结果,该序列与解淀粉类芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)的同源性为97%,故确定为解淀粉类芽孢杆菌。


2.3菌株的乳化活性

油脂因其比重小、疏水等性质,使得其大部分均聚集、漂浮于水体表面,形成油层或油滴,限制微生物对其的利用。DK-1能产生具有良好乳化作用的生物表面活性剂,能将油脂乳化使其均匀分散于水体中,故能加大其对油脂的接触面积,更好的降解油脂。经测定DK-1乳化指数为65%,表明DK-1产生的生物活性物质有较好的乳化效果,使该菌株能更好的利用、降解油脂。

2.4菌体生物量的变化

菌体在培养体系中生物量的变化如图2。图2表明菌体接种后适应性好,繁殖能力强,菌体生物量在前40h呈现持续上升的趋势,无明显的延滞期,在40h时其OD菌体值达18.36,在40h后菌体生物量达到稳定状态,菌体生物量不再增加。


2.5油脂去除率随时间的变化

微生物对油脂的去除主要依靠自身分泌出的脂肪酶水解乳化体系中的油脂分子成为可被吸收利用的小分子,进而被进一步降解来完成的。图3表明,随着时间的延长,菌株的油脂去除率相应增加,在前8h对油脂的去除速率较慢,在8~16h时迅速增大,在48h时其去除率达97.3%。

2.6CODCr随时间的变化

油脂、蛋白质等大分子物质是引起水体中CODCr增加的主要成分。图4表明,DK-1对高含油废水中的CODCr去除有明显效果。在48h时,经离心后上清液的CODCr降为4492mg/L,对CODCr去除率达91.9%。


3结论

从餐馆隔油池废水中分离到一株高效油脂降解

 

菌DK-1,经16SrDNA鉴定确定为解淀粉类芽孢杆菌。经实验表明,当油脂质量浓度为5g/L时,菌体能迅速生长繁殖,到40h时其菌体的OD菌体值达18.36,培养48h后其油脂去除率为97.3%,CODCr的去除率为91.9%。且该菌能产生具有良好乳化效果的生物表面活性剂,使得培养液能迅速被乳化成白色均匀的体系,其乳化指数为65%,表明该物质能产生稳定的乳化效果。但其产生的表面活性剂的成分尚未确定,还需进一步的研究。由于该菌自身能乳化油脂,因此在除油过程中无需额外投加乳化剂或表面活性剂,在一定程度上降低了油脂废水的处理成本,故该菌对于油脂废水的处理具有较好的应用前景,如将其与其他无乳化活性的降油菌联合使用的话可进一步缩短处理时间,提高油脂废水处理效率。

参考文献:
[1] TORU M,AKIRA M,TOSHIO I,et al.Effect of fatty oil dispersion on oil-containing wastewater treatment[J]. Journal of Hazardous Materials, 2005,118(1/3):255-258.
[2] MonGKOLTHANARUK W, DHARMSTHITI S.Biodegradation of lipid-rich wastewater by a mixed bacterial consortium[J]. International Biodeterioration & Biodegradation,2002,50(2): 101-105.
[3] SHOKROLLAHZADEH S, AZIZMOHSENI F, GOLMOHAMMAD F,et al.Biodegradation potential and bacterial diversity of a petrochemical wastewater treatment plant in Iran[J].Bioresource Technology 2008,99(14): 6127-6133.
[4] CAMMAROTA M C, FREIRE D M G .A review on hydrolytic enzymes in the treatment of wastewater with high oil and grease content[J]. Bioresource Technology ,2006,97(17): 2195-2210.
[5] DANALEWICH J R, PAPAGIANNIS T G, BELYEA R.L, et al. Characterization of dairy waste streams, current treatment practices, and potential for biological nutrient removal[J].Water Res,1998, 32(12):3555-3568.
[6] MARSHALL K R, HARPER W J. The treatment of wastes from dairy industry[J]. Food and Allied Industries,1984(1)296-376.
[7] LOPERENA L, FERRARI M D, DíAZ A L,et al. Isolation and selection of native microorganisms for the aerobic treatment of simulated dairy wastewaters[J]. Bioresource Technology,2009,100(5):1762-1766.
[8] LIU Y, BUCKLEY J S. Evolution of wetting alteration by adsorption from crude oil. SPE Formation evaluation, 1997, 12(1): 5-11.
[9] 沈叔平,汪小梅.废水中动植物油脂的紫外分光光度测定法[J]. 中国环境监测,1994,10(3):4-7.

上一篇:几种抗氧化剂对山茶油的氧化抑制作用研究 下一篇:相转移催化合成大豆油蔗糖多酯初步研究