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酶解辅助反胶束法萃取小麦胚芽蛋白前萃工艺的优化

发布日期:2018-06-12 中国油脂网

 毛丙永,张海华,朱科学

(江南大学 食品学院,江苏 无锡 214122)


摘要:采用由AOT(琥珀酸二(2-乙基己基)酯磺酸钠)-异辛烷-KCl缓冲液组成的反胶束体系,联合酶解技术提取脱脂小麦胚芽蛋白。探讨了反应时间、缓冲液pH、酶加量3个因素对蛋白前萃率的影响,并用响应面优化前萃工艺条件。经响应面分析得到稳定点为鞍点,采用岭嵴分析进一步优化得到最佳小麦胚芽蛋白前萃工艺条件为:反应温度40 ℃,反应时间1 h,缓冲液pH 9.22,酶加量0153 AU/g。在此最佳工艺条件下,蛋白前萃率达到76.99%。
关键词:酶解;反胶束;小麦胚芽蛋白;响应面;岭嵴分析
中图分类号:TS229;TS202   文献标志码:A   文章编号:1003-7969(2010)02-0029-04

Optimization of enzymatic extraction of wheat germ 
protein by reverse micelles
MAO Bingyong, ZHANG Haihua, ZHU Kexue
(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China)


Abstract:Reverse micelles combined enzyme hydrolysis was adopted to extract wheat germ protein. Reverse micelles system was formed by sulphosuccinic acid bis (2-ethylhexyl) ester sodium salt (AOT), isooctane and KCl buffer solution. Effects of extraction time, the pH of buffer solution and enzyme dosage on forward extraction efficiency were investigated. Response surface methodology was applied to optimize the forward extraction condition, and the stationary point got from response surface model was the saddle point. The ridge analysis was developed to further study the results, and the maximum forward extraction efficiency of 76.99% was obtained at the condition of temperature 40 ℃, extraction time 1 h, pH 9.22 and enzyme dosage 0.153 AU/g.
Key words:enzymatic hydrolysis; reverse micelles; wheat germ protein; response surface methodology; ridge analysis

自从20世纪70年代瑞士的Luisi等[1]人首次提出用反胶束法萃取蛋白质以来,反胶束体系已经越来越受到关注。目前,反胶束体系用来提取蛋白已有很多报道,孙晓宏等[2]人利用AOT/异辛烷反胶束萃取小麦胚芽蛋白,优化前萃工艺使提取率达到34.55%;陈复生等[3]人做了AOT/异辛烷反胶束萃取大豆蛋白同时酶水解的研究,证实了蛋白酶的加入有利于大豆蛋白提取率的提高。
    小麦胚芽蛋白质含量高,且品质优良,含有人体必需的8种氨基酸,相互比值与FAO/WHO颁布的氨基酸构成比例基本接近,是一种优质的植物蛋白。本试验采用酶-反胶束体系从脱脂小麦胚芽中提取蛋白,探索酶解技术联合反胶束法萃取脱脂小麦胚芽蛋白的最佳工艺条件,为高效提取和综合利用小麦胚芽蛋白提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂

脱脂小麦胚芽:永城弥诺食品有限公司提供,过100目筛;诺维信碱性蛋白酶 Alcalase 2.4L:诺维信(中国)生物技术有限公司;琥珀酸二(2-乙基己基)酯磺酸钠 [sulphosuccinic acid bis (2-ethylhexyl) ester sodium salt, AOT]:分析纯,使用前置于105 ℃烘箱烘3 h;异辛烷、氯化钾、硼酸、氢氧化钠、卡尔-费休试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器

EL204-IC 电子天平,90-磁力搅拌器,SHA-B水浴恒温振荡器,LXY-Ⅱ离心沉淀机。

1.3 试验方法

1.3.1 原料脱脂小麦胚芽蛋白质含量的测定 按照GB/T 5511—2008测定。

1.3.2 反胶束体系W0的测定 反胶束体系的含水量用非极性溶剂中水的浓度与表面活性剂浓度之比W0表示,用卡尔-费休法测出。

1.3.3 反胶束提取-酶解小麦胚芽蛋白工艺

1.3.3.1 反胶束的制备 见参考文献[2]。

1.3.3.2 反胶束提取-酶解工艺 将准确称量的05 g(精确到0.001 g)脱脂小麦胚芽加入到上述反胶束中,置于水浴恒温振荡器中,调节转速和温度,反应一段时间。反应结束,沸水浴5 min灭酶,3 000 r/min离心20 min,采用凯氏定氮法测定上清液中蛋白含量。

1.3.4 小麦胚芽蛋白前萃率计算

前萃率=上清液中蛋白质的量/反应前体系中蛋白质的量×100%

1.3.5 响应面试验设计 根据Box-Behnken中心组合试验设计原理,以反应时间(X1)、缓冲液pH(X2)、酶加量(X3)3因素为自变量,小麦胚芽蛋白前萃率(Y)为响应值,设计响应面试验进行工艺条件优化,各因素水平安排见表1。


表1 响应面分析因素与水平

 水 平 因 素
X1/h X2 X3/(AU/g)
-1 0.5 8 0.15
 0 1.0 9 0.25
 1 1.5 10 0.35

1.3.6 试验数据处理与分析 采用SAS(Version 8.1)软件进行数据处理和回归分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 反应温度对蛋白前萃率的影响 在酶加量0.15 AU/g、反应时间1 h、缓冲液pH 8的条件下,改变反应温度,按1.3.3操作,考察反应温度对蛋白前萃率的影响,结果见图1。

由图1可知,反应温度由25 ℃上升到40 ℃,前萃率不断增加,继续提高温度,前萃率有所下降。采用SAS软件进行单因素方差分析得出P小于0.0001,说明反应温度对蛋白前萃率影响极显著。由图1方差分析标识可知,不同温度水平下蛋白前萃率差异显著。因此,可以选取40 ℃作为反应温度来研究其他因素对蛋白前萃率的影响。

2.1.2 反应时间对蛋白前萃率的影响 在酶加量0.35 AU/g,缓冲液pH 9的条件下,改变反应时间,按1.3.3操作,考察反应时间对蛋白前萃率的影响,结果见图2。

QQ截图20180524134802.pngQQ截图20180524134949.png

由图2可知,从反应开始到0.5 h,蛋白前萃率迅速上升至70%,较单独用反胶束提取小麦胚芽蛋白时的前萃率34.55%[1]有了大幅度的提高,这是因为起始时底物蛋白浓度大,酶解反应初始速率高,水解产生小分子肽类,进入“水池”空间阻碍减小,传质速率增加。随着时间延长,“水池”内的蛋白浓度持续增加,蛋白质进入“水池”的空间位阻增加,前萃率增加变缓,1.0 h时达到77%。继续延长反应时间,蛋白质进入“水池”速率小于溶出速率,使得前萃率略有下降,在1.5 h时反应达到动态平衡,继续增加反应时间前萃率不再变化。
    2.1.3 缓冲液pH对蛋白前萃率的影响  在酶加量0.25 AU/g,改变缓冲液pH,按1.3.3的操作,考察缓冲液pH对蛋白前萃率的影响,结果见图3。

QQ截图20180524135139.png

活力的影响;③pH对带电产物传递的影响。另外,影响传质的推动力还有疏水相互作用、氢键、离子强度和静电相互作用[5]。

在pH为8的弱碱性环境中,碱性蛋白酶活力较小,蛋白水解程度小,较大的产物分子不易增溶于“水池”;pH为10时,起主导作用的是OH-与阴离子表面活性剂AOT间较强的静电排斥作用,使得“水池”半径增大,增溶大分子蛋白质的能力增强,所以前萃率较pH为8时高;pH为9时,碱性蛋白酶活力较高,蛋白水解充分,产物分子较小,亲水基团暴露更多,同时适当的静电排斥作用利于维持反胶束体系的稳定,使传质迅速进行,前萃率较高,可达到77%。另外,图中3条曲线随时间变化趋势不完全相同,pH为9时,蛋白前萃率一直处于较高的水平,且波动幅度较小;pH为10时蛋白前萃率随时间延长缓缓增长;pH为8时维持在58%~63%的较低水平;这是因为不同pH条件下酶解反应进程差异较大,对反胶束体系造成的影响各不相同,反胶束体系的变化又会影响到酶解反应的进行,二者相互作用共同影响蛋白的前萃过程。

2.1.4 酶加量对蛋白前萃率的影响 在缓冲液pH为9,改变酶加量,按照1.3.3操作,考察酶加量对蛋白前萃率的影响,结果见图4。

QQ截图20180524135244.png

孙晓宏等[2]人做了AOT/异辛烷反胶束提取小麦胚芽蛋白的研究,最大前萃率达到34.55%。而在本试验条件下,加入碱性蛋白酶后,前萃率有了明显提高,0.5 h达到70%以上。据报道,酶在反胶束体系中可以保持甚至提高其催化活性[4]。因为高度分散的反胶束体系为酶催化反应提供了巨大的相界面,酶与底物接触充分,水解程度大,产物分子小,容易增溶于“水池”。反胶束一直处于动态的变化过程,不断地碰撞结合、分散,再结合再分散,结果导致“水池”间不断进行物料交换,蛋白质可以增溶也可溶出“水池”,水解作用改变了蛋白质分子表面疏水基团与亲水基团的比例,影响到蛋白质的萃取。由图4可见,酶加量为0.15、0.25 AU/g的蛋白前萃率随时间变化趋势一致,1.5 h基本达到平衡,而酶加量为0.35 AU/g,10 h时蛋白前萃率最大,继续延长时间,前萃率略有下降并趋于平衡,目前关于这一曲线的变化,在所能查阅的资料范围内未能得到合理解释,有待进一步研究。另外,由曲线还可以看出,酶加量为0.35 AU/g,1.0 h时前萃率达到最大值77.52%,0.25 AU/g时,在1.5 h达到最大前萃率76.92%,0.15 AU/g时,前萃率在2.0 h达到最大值76.97%,三者相差很小。对于酶加量0.35 AU/g,起始反应速率高,所以达到最大值需要时间短。生产中,可以根据实际情况选取合适的酶加量及反应时间。

2.2 响应面试验分析

Box-Behnken试验设计方案和响应值见表2,回归方程中各系数及显著性见表3,方差分析及典型分析见表4、表5。

采用SAS软件对各因素回归拟合,得到二次多项式方程为:

Y=72.086 667+0.513 750X1+2.290 000X2-1.238 750X3-1.552 083X21+2.770 000X1X2-9.424 583X22+1.722 500X1X3-3.525 000X2X3+2.182 917X23

由表3可知,一次项X2对响应值Y影响高度显著,平方项中X22,X23对响应值Y影响均显著;交互项中只有X1X3对响应值Y影响不显著。从而得出因素主效应关系为:pH>酶加量>反应时间。

由表4方差分析结果看出,一次项P影响显著,二次项和交互项影响高度显著,失拟项P大于0.05,影响不显著,回归模型R2=0.977 7,P=0.001 3,表明模型高度显著,回归方程与试验结果拟合程度很好,选用的二次回归模型是适当的。

从表5典型分析结果可以看出,特征值有正有负,从而稳定点为鞍点,非极值,因此不能从二次响应面上直接找出最佳工艺参数,需要进一步进行岭嵴分析。


表2 响应面试验设计及结果

试验号 X1  X2  X3 Y/%
1 0 -1 -1 61.86
2 0 -1 1 65.02
3 0 1 -1 71.72
4 0 1 1 60.78
5 -1 0 -1 74.22
6 -1 0 1 69.71
7 1 0 -1 72.28
8 1 0 1 74.66
9 -1 -1 0 60.43
10 -1 1 0 61.24
11 1 -1 0 55.44
12 1 1 0 67.33
13 0 0 0 72.02
14 0 0 0 71.42
15 0 0 0 72.82

表3 回归方程系数及其显著性

变 量 回归系数 标准差 F P>F
常数项 72.086 667 0.883 130 81.63 <0.000 1
X1 0.513 750 0.540 805 0.95 0.385 7
X2 2.290 000 0.540 805 4.23 0.008 2
X3 -1.238 750 0.540 805 -2.29 0.070 6
X21 -1.552 083 0.796 043 -1.95 0.108 7
X1X2 2.770 000 0.764 813 3.62 0.015 2
X22 -9.424 583 0.796 043 -11.84 <0.000 1
X1X3 1.722 500 0.764 813 2.25 0.074 1
X2X3 -3.525 000 0.764 813 -4.61 0.005 8
X23 2.182 917 0.796 043 2.74 0.040 7

表4 方差分析

回归分析 自由度 平方和 R2 F P>F
一次项 3 56.340 325 0.107 6 8.03 0.023 4
二次项 3 363.366 092 0.693 9 51.77 0.000 3
交互项 3 92.262 125 0.176 2 13.14 0.008 3
回归和 9 511.968 542 0.977 7 24.31 0.001 3
失拟项 2 10.712 125   7.24 0.123 8
纯误差 3 0.986 667      
残差和 5 11.698 792      
总离差 14 523.667 334      

表5 典型分析

特征值 特征向量
X1 X2 X3
2.551 885 0.163 137 -0.125 153 0.978 633
-1.391 709 0.970 772 0.197 346 -0.136 589
-9.953 927 -0.176 035 0.972 312 0.153 690

岭嵴分析结果如表6所示,编码半径为0对应未编码稳定点(X1,X2,X3) =(1.000 000,9.000 000,0.250 000),随编码半径的增加给出了一系列参考试验点即岭嵴,当编码半径为1.0时响应值取到最大值。因此,确定酶解-反胶束联合萃取脱脂小麦胚芽蛋白的最佳工艺参数为:反应时间1 h,缓冲液pH 9.22(20.0 ℃),酶加量0.153 AU/g。最佳条件下蛋白前萃率为(76.19±0.95)%。在最佳条件下进行验证试验,平行3次,得到脱脂小麦胚芽蛋白前萃率为76.99%,在模型预测值范围[75.24%,77.14%]内,基本吻合。


表6 岭嵴分析

编码
半径
预测响应值 标准差 未编码因素水平
X1 X2 X3
0.0 72.086 667 0.883 130 1.000 000 9.000 000 0.250 000
0.1 72.326 040 0.880 394 1.010 564 9.062 160 0.242 457
0.2 72.570 704 0.872 502 1.014 604 9.093 525 0.232 564
0.3 72.853 285 0.860 555 1.013 471 9.115 022 0.222 424
0.4 73.181 613 0.846 552 1.009 761 9.132 789 0.212 319
0.5 73.558 313 0.833 487 1.004 660 9.148 766 0.202 274
0.6 73.984 512 0.825 431 0.998 732 9.163 743 0.192 278
0.7 74.460 779 0.827 436 0.992 273 9.178 103 0.182 321
0.8 74.987 432 0.845 103 0.985 453 9.192 054 0.172 394
0.9 75.564 662 0.883 744 0.978 377 9.205 719 0.162 489
1.0 76.192 592 0.947 392 0.971 112 9.219 177 0.152 603

3 结 论

本研究将酶解技术应用于反胶束体系中辅助提取脱脂小麦胚芽蛋白,研究了反应时间、缓冲液pH、酶加量3个主要因素对蛋白前萃率的影响,得到主效应关系依次为:缓冲液pH、酶加量、反应时间。进一步采用响应面回归和岭嵴分析法优化了蛋白前萃工艺,确定最佳条件为:反应温度40 ℃,反应时间1 h,缓冲液pH 9.22,酶加量0.153 AU/g。在此最佳工艺条件下,蛋白前萃率达到76.99%。

参考文献:

[1] LUISI P L, BonNER F J, PELLEGRINI A, et al. Micellar solubilization of proteins in aprotic solvents and their spectroscopic characterization[J]. Helvetica Chimica Acta, 1979,62(3):740-753.

[2] 孙晓宏, 朱科学, 周惠明. 反胶束法提取小麦胚芽蛋白前萃工艺的优化[J]. 中国粮油学报, 2008,23(4):38-42.

[3] 陈复生, 姚永志, 磨礼现,等. 利用反胶束萃取大豆蛋白同时酶水解的研究[J]. 中国粮油学报, 2006,21(1):68-70. 

[4] ANDRADE S L A,MOURA J J G. Hydrogen evolution and consumption in AOT-isooctane reverse micelles by Desulfovibrio gigas hydrogenase[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2002,31:398-402. 

[5] NISHIKI T, SATO L, MUTO A, et al. Mass transfer characterization in forward and back extractions of lysozyme by AOT-isooctane reverse micelles across a flat liquid-liquid interface[J]. Biochemical Engineering Journal, 1998(1):91-97.


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