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高效降解棉酚菌种的筛选及棉粕发酵脱毒工艺研究

发布日期:2018-06-15 中国油脂网

 朱德伟1,2,刘志鹏2,蔡国林2,曹 钰2,王兴国3,陆 健1,2

(1.  江南大学 工业生物技术教育部重点实验室,江苏 无锡 214122; 2.江南大学 生物工程学院,
江苏 无锡 214122; 3. 江南大学 食品学院,江苏 无锡 214122)

摘要:通过醋酸棉酚YPG培养基多级逐步驯化筛选,结合棉粕固态生物发酵的方法,筛选出1株高效降解棉酚的热带假丝酵母JD-9。通过单因素试验初步确定了棉粕发酵脱毒的工艺条件,进一步利用分式析因试验设计法,对影响棉粕脱毒率的因素进行了筛选,方差分析表明,影响棉粕发酵脱毒的主要因素为热带假丝酵母JD-9接种量和卡氏酵母JD-13接种量。通过响应面分析法和典型性分析得出棉粕发酵脱毒的最优条件为:热带假丝酵母JD-9接种量4.42%,卡氏酵母JD-13接种量0.56%,发酵时间48 h,发酵温度30 ℃,料水比1∶ 0.8,棉粕中的棉酚从987.5 mg/kg降解至85.9 mg/kg,脱毒率达到91.3%。
    关键词:棉粕;棉酚;脱毒;发酵
    中图分类号TS229;S816    文献标志码:A    文章编号:1003-7969(2010)02-0024-05


Screening of gossypol-degrading strain and its application
in fermentation of cottonseed meal

ZHU Dewei1,2,LIU Zhipeng2,CAI Guolin2,CAO Yu2,
WANG Xingguo3,LU Jian1,2
(1.Key Lab of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122,
Jiangsu,China; 2.School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,Jiangsu,China;
3. School of Food Science,Jiangnan University,Wuxi 214122,Jiangsu,China)

 

Abstract:The YPG medium containing acetic gossypol was used for the gossypol-degrading strain screening.A strain of Candida tropicalis JD-9 with high efficiency of gossypol-degrading was screened out.The methods of single factor experiments,fractional factorial experimental design and central composite experimental design were used to optimize the process parameters for detoxification of gossypol in cottonseed meal by Candida tropicalis JD-9 during solid substrate fermentation.The optimum fermentation conditions were as follows:inoculums level of JD-9(Candida tropicalis)4.42%,inoculums level of JD-13(S.carlsbergensis)0.56%,incubation time 48 h,incubation temperature 30 ℃,ratio of material to water 1∶ 0.8.Under the optimum conditions,the content of gossypol reduced from 987.5 mg/kg to 85.9 mg/kg,and the detoxification efficiency was up to 91.3%. 
    Key words:cottonseed meal;gossypol;detoxification;fermentation

棉粕是丰富的蛋白来源,含粗蛋白40%左右,粗纤维约11%,此外B族维生素、硫胺素和有机磷也较多,是重要的蛋白质饲料资源。我国是一个产棉大国,每年可生产600多万t棉粕,在我国饼粕类饲料原料中,其产量仅次于大豆粕,而使用量仅为30%,饲料工业的发展目标为:到2010、2020年力争使棉粕饲用比例提高到80%和85%[1]。但由于棉粕含有有毒物质棉酚(700~2 500 mg/kg),会对动物生产、发育和繁殖等产生不良影响[2,3],限制了其应用,部分地区甚至将其作肥料,造成饲料资源的严重浪费。研究证明,棉粕中游离棉酚含量在0.02%以下时,对动物不具有毒性,我国规定棉籽油中游离棉酚含量不大于0.02%[4]。

 棉粕的脱毒主要可分为物理脱毒法、化学钝化法、溶剂浸出法和生物脱毒法等。然而传统的挤压脱毒法脱毒率低,碱处理之类的化学钝化法对设备的抗腐蚀要求高,会降低饲料的适口性,溶剂浸出法会造成溶剂残留等缺点[5-8],因此近几年棉粕的脱毒方法主要是微生物发酵脱毒[1,4,9]。
     本研究尝试从适用于饲料原料发酵的酵母属菌株出发,通过逐级平板驯化法筛选高效降解棉酚的菌株,并利用筛选得到的菌株固态发酵棉粕,通过发酵过程条件优化,得到低棉酚的发酵棉粕,提高棉粕的营养价值和利用率。
    1 材料与方法

1.1 菌种

产朊假丝酵母JD-1、JD-2、JD-3和JD-4,热带假丝酵母JD-5、JD-6、JD-7、JD-8和JD-9,啤酒酵母JD-10、JD-11和JD-12,卡氏酵母JD-13,共13株酵母,是实验室保藏的适用于饲料原料生物技术处理的菌株。

1.2 试剂、原料

正己烷、异丙醇、冰乙酸、苯胺、3-氨基-1-丙醇均为分析纯试剂。棉粕购自无锡粮油市场。

1.3 培养基

YPG培养基:酵母膏5 g,蛋白胨10 g,葡萄糖20 g,加水至1 000 mL,自然pH,固体培养基加入2%的琼脂。三级筛选培养基平板和驯化培养基分别加入02%、0.4%和0.6%醋酸棉酚后,于121 ℃灭菌20 min。

1.4 菌种筛选

1.4.1 平板筛选 菌种初筛通过多级逐步驯化进行,保藏菌种活化后在含0.2%醋酸棉酚的YPG培养基平板第1次点种,挑选较大菌落至含0.2%醋酸棉酚的YPG液体培养基扩培;在含0.4%醋酸棉酚的YPG培养基平板上第2次点种,挑选较大菌落至含0.4%醋酸棉酚的YPG液体培养基扩培;在含0.6%醋酸棉酚的YPG培养基平板第3次点种,从而筛选出降解棉酚能力强的菌株。

1.4.2 棉粕固态发酵复筛 将平板筛选的酵母菌分别接入YPG斜面培养基,30 ℃培养72 h,挑取1环菌苔分别接入含10 mL YPG液体培养基的试管中,30 ℃培养18 h,再吸取5 mL接入含50 mL YPG液体培养基的250 mL三角瓶中,30 ℃、150 r/min培养20 h,取6 mL菌液接入灭过菌的棉粕中(30 g棉粕,24 mL水),30 ℃发酵60 h,80 ℃烘3 h,粉碎,测定脱毒率。

1.5 棉粕固态发酵工艺优化

1.5.1 单因素试验 首先研究热带假丝酵母JD-9接种量对脱毒率的影响,将经三角瓶培养的热带假丝酵母JD-9菌液分别按2%、4%、6%、8%和10%的接种量接入灭过菌的棉粕(30 g棉粕,24 mL水)中,不接种卡氏酵母JD-13,30 ℃发酵60 h。发酵结束后,80 ℃烘干3 h,粉碎,测定脱毒率。

以最优的热带假丝酵母JD-9接种量,研究卡氏酵母JD-13接种量对脱毒率的影响,不改变上述其他试验条件。同理,再分别研究发酵温度、发酵时间和料水比对脱毒率的影响。

1.5.2 微生物发酵脱毒的响应面分析优化[10,11] 利用SAS软件中N=8的分式析因试验设计法对微生物发酵脱毒的参数进行筛选。试验设计的每个因素取2个水平,对5个因素:热带假丝酵母JD-9的接种量、卡氏酵母JD-13的接种量、发酵温度、发酵时间和料水比进行研究。在确定主因素后,再利用SAS软件的响应面分析法进行进一步的优化。

1.6 棉酚的测定

采用国标苯胺法[12],本方法适用于棉粕和含有棉粕的配合饲料中游离棉酚的测定。

2 结果与讨论

2.1 菌种筛选

2.1.1 醋酸棉酚YPG培养基上的筛选 第1次在0.2%醋酸棉酚YPG平板点种并培养3 d后,除啤酒酵母JD-11和啤酒酵母JD-12没有生长外,其他菌株生长良好。由于添加了一定浓度的醋酸棉酚,产朊假丝酵母JD-1和产朊假丝酵母JD-3生长缓慢,因此通过第1次平板点种筛选将以上4个菌株淘汰。

第1次挑选出来的菌种经0.2%醋酸棉酚液体培养基驯化扩培后,第2次在0.4%醋酸棉酚平板上点种,由于醋酸棉酚浓度的提高,有些菌株生长速度减慢。除了产朊假丝酵母JD-2、产朊假丝酵母JD-4、热带假丝酵母JD-7、啤酒酵母JD-10和卡氏酵母JD-13外,其他菌株生长较好,因此通过第2次点种将以上5个菌株淘汰。

第2次挑选出来的菌株经0.4%醋酸棉酚液体培养基驯化扩培后,第3次在0.6%醋酸棉酚平板上点种。并培养3 d后,热带假丝酵母JD-6与热带假丝酵母JD-9生长较好,菌落较大,其他两株生长较慢,菌落较小,初步确定热带假丝酵母JD-6和热带假丝酵母JD-9为降解棉酚能力较强的菌种。

2.1.2 棉粕固态发酵复筛高效降解棉酚菌株 通过热带假丝酵母JD-9发酵脱毒后的棉粕中游离棉酚含量明显减少,从987.5 mg/kg减少到169.8 mg/kg,脱毒率达到了82.8%。热带假丝酵母JD-6发酵脱毒后的棉粕游离棉酚含量也明显减少,从987.5 mg/kg减少到213.3 mg/kg,脱毒率为78.4%。结果表明热带假丝酵母JD-9是一株高效的棉酚降解菌株。

2.2 棉粕固态发酵脱毒工艺参数的优化

2.2.1 热带假丝酵母JD-9接种量对脱毒率的影响 接种量是关系到棉粕发酵脱毒效率的一个重要因素。不同的热带假丝酵母JD-9接种量对棉粕发酵脱毒率的影响如图1所示。由图1可见,随着接种量的提高,棉粕的脱毒率提高,当接种量达到4%(V/m)时,棉粕的脱毒率达到了82%,而后加大接种量脱毒率的提高幅度很小,因此在后续的研究中采用4%的接种量。



QQ截图20180524113207.png

2.2.2 卡氏酵母JD-13接种量对脱毒率的影响 棉粕中棉籽糖约占9%,是最主要的含碳物质。热带假丝酵母JD-9无法分解利用棉籽糖从而限制其生长。本实验室获得的适合用于饲料原料生物技术处理的卡氏酵母JD-13可以分解利用棉籽糖,因此将其按一定量接种,进行混合发酵,不仅可以充分利用棉粕中的不同糖类物质,还有利于热带假丝酵母JD-9的生长和降解棉酚,提高脱毒率。

不同的卡氏酵母JD-13接种量对棉粕脱毒率的影响如图2所示。由图2可见,当接种量为0.5%时,脱毒率最高,达到90.4 %,再提高接种量反而降低了脱毒率,这可能是由于提高了卡氏酵母JD-13的接种量,使得卡氏酵母的生长占主导,抑制了热带假丝酵母JD-9的生长。

2.2.3 发酵温度对脱毒率的影响 不同发酵温度对脱毒率的影响如图3所示。由图3可见,在25~30 ℃之间,随着发酵温度的上升,脱毒率随之提高,

QQ截图20180524113328.png

但当发酵温度超过32 ℃后,发酵脱毒率显著降低,说明高温对发酵脱毒有负面影响,而当发酵温度较低时,微生物的代谢活动降低,从而影响脱毒率。

QQ截图20180524113449.png

2.2.4 发酵时间对脱毒率的影响 发酵时间对脱毒率的影响如图4所示。由图4可见,当发酵时间为48 h时,脱毒效果较好,脱毒率达到90.4 %,再延长发酵时间对提高脱毒率的影响不大,因此采用48 h的发酵时间比之前的60 h更有利于工业生产。

QQ截图20180524113601.png

2.2.5 料水比对脱毒率的影响 料水比对脱毒率的影响如图5所示。由图5可见,当料水比为1∶ 0.8时,底物发酵脱毒率达最大值90.8%,过高的水分含量可能减少了底物的通透性,从而改变热带假丝酵母JD-9的性能,降低脱毒率。而底物水分含量过低可能引起棉粕营养物质的溶解性减少,以及底物颗粒的膨胀程度降低,从而影响发酵脱毒效果。
    2.2.6 发酵工艺的优化 为筛选影响棉粕发酵脱

QQ截图20180524113707.png

毒的主要因素,对热带假丝酵母JD-9接种量(X1)、卡氏酵母JD-13接种量(X2)、发酵温度(X3)、发酵时间(X4)和料水比(X5)5个因素进行了N=8的分式析因设计试验,结果如表1所示。


表1 影响棉粕发酵脱毒的分式析因设计

试验号

X1/%

X2/%

X3/℃

X4/ h

X5

脱毒率Y1/%

1

2

0.25

25

60

1∶ 1

71.8

2

6

0.25

25

36

1∶ 0.6

86.8

3

2

0.75

25

36

1∶ 1

88.4

4

6

0.75

25

60

1∶ 0.6

90.0

5

2

0.25

35

60

1∶ 0.6

72.6

6

6

0.25

35

36

1∶ 1

82.8

7

2

0.75

35

36

1∶ 0.6

82.0

8

6

0.75

35

60

1∶ 1

88.0

 表2列出5个因素在分式析因设计下影响棉粕发酵脱毒的主效应分析。方差分析表明,试验数据具有统计学意义,显著因子为热带假丝酵母JD-9的接种量(P=0.048 2)和卡氏酵母JD-13的接种量(P=0.044 1)。


表2 分式析因设计下的主效应分析

影响因素

SS

MS

F

P﹥F

X1

134.48

134.48

19.266 5

0.048 2*

X2

147.92

147.92

21.192 0

0.044 1*

X3

16.82

16.82

2.409 7

0.260 8

X4

38.72

38.72

5.547 3

0.142 7

X5

0.02

0.02

0.002 9

0.962 2

通过分式析因设计能够确定出影响棉粕发酵脱毒的主要因素,但不能确定参数的具体值以及各参数之间的交互作用,采用中心组合试验设计进一步优化影响因素。本试验设计采用2因素3水平的中心组合试验设计(CCD),将分式析因设计得到的显著因素热带假丝酵母JD-9接种量和卡氏酵母JD-13接种量重新编码并进行水平标注。
    表3列出了CCD试验设计下棉粕发酵脱毒的结果,其中第9~13次试验为5次重复的中心点试验,用于考察模型的误差。


表3 中心组合试验设计下棉粕发酵的脱毒率

试验序号

X1/%

X2/%

Y1/%

1

2

0.25

68.6

2

2

0.75

88.6

3

6

0.25

82.4

4

6

0.75

88.4

5

1.2

0.5

72.6

6

6.8

0.5

86.8

7

4

0.24

81.2

8

4

0.76

83.2

9

4

0.5

90.4

10

4

0.5

90.6

11

4

0.5

90.6

12

4

0.5

90.8

13

4

0.5

90.8

对CCD试验设计结果进行方差分析,经F值检验显示总模型方程高度显著(P﹤0.001),R2值为0.960 3 ,说明96.03%的脱毒率变异分布在所考察的2个因子中,总变异中仅有3.87%不能由该模型来解释。通常CV值(变异系数)反映模型的置信度,即CV值越低,模型的置信度越高;本试验设计的CV值为3.19,说明模型方程能够很好地反应真实的试验数据。一次项和二次项的P值都小于0.001,说明模型方程的一次和二次项都高度显著,因此该试验设计可以通过二阶模型方程进行描述。
  表4列出2个因素在CCD试验设计下影响棉粕脱毒率的回归方程系数及其显著性检验。


表4 CCD试验设计下影响棉粕脱毒率的
回归方程系数及其显著性检验

 

变量

回归系数

标准偏差

t

P >︱t︱

常数项

90.63

1.46

61.93

<0.000 1**

X1

4.23

1.16

3.64

0.008 3**

X2

3.64

1.16

3.13

0.016 7**

X21

-5.26

1.26

-4.18

0.004 2**

X1X2

-3.50

1.64

-2.14

0.069 7*

X22

-3.98

1.26

-3.16

0.015 8**

方差分析表明,热带假丝酵母JD-9接种量和卡氏酵母JD-13接种量的一次项和二次项都对棉粕的脱毒有显著影响(P<0.05),而交互项不显著。因此,棉粕的脱毒率可以通过式(1)进行描述:
     Y1 = 90.63+4.23X1+3.64X2-5.26X21-3.5X1X2-3.98X22

    图6为根据上述二元二次方程所作的响应面等高线图及其响应面立体分析图。利用该图可看出两个变量交互影响棉粕脱毒的效应,并对其进行分析与评价,从中确定最佳因素的水平范围。由图6可以看出,当热带假丝酵母JD-9接种量在0.1~0.4(4.2%~4.8%),卡氏酵母JD-13接种量在02~0.4(0.55%~0.6%)时,棉粕脱毒率较高。

QQ截图20180524114236.png

对模型方程进行典型性分析表明,模型具有稳定点,稳定点为其最大值。在最优条件下,发酵条件为:热带假丝酵母JD-9接种量4.42%,卡氏酵母JD-13接种量0.56%,脱毒率最高为918%。
    为了证明模型预测的准确性,进行3次平行最优条件下的重复性试验,脱毒率分别为907%、921%、905%,平均值为913% 。说明模型方程真实可行,能够很好地预测试验结果。

 

3 结 论

通过醋酸棉酚YPG培养基多级逐步驯化筛选,结合棉粕固态生物发酵的方法,筛选出1株高效降解棉酚的热带假丝酵母JD-9。通过单因素试验初步确定了棉粕发酵脱毒的最佳条件为:发酵时间48 h,发酵温度30 ℃,热带假丝酵母JD-9接种量4%,料水比1∶ 0.8,卡氏酵母JD-13接种量0.5%。

进一步利用分式析因试验设计法,对影响棉粕脱毒率的因素进行了筛选,方差分析表明,影响棉粕发酵脱毒的主要因素为:热带假丝酵母JD-9接种量和卡氏酵母JD-13接种量。通过响应面分析法和典型性分析得出棉粕发酵脱毒的最优条件为:热带假丝酵母JD-9接种量4.42%,卡氏酵母JD-13接种量0.56%,发酵时间48 h,发酵温度30 ℃,料水比1∶ 08,棉粕中的棉酚从9875 mg/kg降解至859 mg/kg,脱毒率达到913%。

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