您好,欢迎来到中国油脂网 !

登录| 注册| 我的订单| 我的购物车(0)| 帮助中心
微信公众号

029-88626849

菜籽饼粕中硫甙及其降解物分析中存在的问题

发布日期:2018-07-18 中国油脂网

 潘 雷1,李爱科1,吴莹莹2,王英瑶1,栾 霞1,佟建明2,初 雷1

(1.国家粮食局 科学研究院,北京100037; 2.中国农业科学院 畜牧研究所,北京 100193)

 

摘要:阐述了菜籽饼粕中硫甙的降解途径和各种毒素的存在形式,并指出目前测定硫甙、噁唑烷硫酮、异硫氰酸酯、腈类和硫氰酸酯等毒素研究中存在的一些问题,以期为今后的研究提供指导。

关键词:菜籽饼粕;硫甙;分析测定

中图分类号:TS22   文献标志码:A   文章编号:1003-7969(2010)03-0007-05

 

Several problems in analysis of glucosinolates and its degradation 

products in rapeseed meal (cake) 

PAN Lei1,LI Aike1,WU Yingying2,WANG Yingyao1,

LUAN Xia1,TONG Jianming2, CHU Lei1

(1. Academy of State Administration of Grain, Beijing 100037,China;2.Institute of Animal 

Sciences,Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193,China)

Abstract:The degradation pathway of glucosinolates and existing form of toxins in the rapeseed meal(cake)were described,and several problems in the determination of glucosinolates,oxazolidine, isothiocyanate, nitriles and thiocyanate were pointed out so as to provide guidance for following research.

Key words:rapeseed meal(cake); glucosinolates; determination

随着养殖业和饲料工业的迅速发展,蛋白质饲料资源相对匮乏成为制约我国畜牧业发展的主要因素之一,尤其是豆粕和鱼粉严重不足,大量依赖进口,而国际市场豆粕和鱼粉价格居高不下,且有逐年上涨的趋势。解决的办法是一方面节约使用豆粕和鱼粉,提高豆粕和鱼粉的利用率;另一方面积极寻求替代豆粕、鱼粉的蛋白质饲料资源。

    菜籽饼粕营养丰富、全面,含粗蛋白35%~45%,菜籽蛋白为全价蛋白质,几乎不存在限制氨基酸,与大豆粕相比,菜籽饼粕中蛋氨酸、胱氨酸等含硫氨基酸的含量较高,仅赖氨酸含量略低于大豆蛋白,其氨基酸组成与大豆蛋白质以及联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)的推荐值非常接近。此外,菜籽饼粕也是良好的矿物质和维生素来源。因此,菜籽饼粕是一潜在价值很大的饲料蛋白资源。但是菜籽饼粕中含有毒素硫代葡萄糖甙(GS,简称硫甙),残留在饼粕中的硫甙本身无毒,但在芥子酶的作用下会降解成异硫氰酸酯(ITC)、噁唑烷硫酮(OZT)、硫氰酸酯(TC)和腈类(Nitriles)等毒素,动物采食后会对机体产生很大的毒害作用。因此,菜籽饼粕不能大量用作饲料,不能做食品的原料,大多充作肥料,造成蛋白质的极大浪费[1]。

    准确测定硫甙及其各降解产物的含量,是判断菜籽饼粕毒性大小的指标。目前,关于硫甙及其各降解产物的定量测定方法种类繁多,每种方法都有各自的针对面和优点,可根据不同的需要选择不同的方法[2]。但有些检测方法还是存在一些不完善之处,也有些初入菜籽饼粕领域的研究者对毒素检测方法理解上不足,产生了一些错误观点。本文针对这些问题做详细阐述,以期为今后的研究提供帮助。

1 硫甙降解途径

为方便阐述菜籽饼粕毒素研究中存在的问题,有必要先了解硫甙的理化性质、分类和降解途径。

     硫甙是一类广泛存在于十字花科(Cruciferae)植物根、茎果实的糖甙化合物,又叫硫葡萄糖甙、硫代葡萄糖甙、硫代葡萄糖苷、芥子甙,是一种含硫的阴离子亲水性植物次生代谢产物,是非活性物质,易溶于水、乙醇、甲醇、丙醇。这些有机溶剂的20%水溶液,更易溶解硫甙。Ettinger和Lundeen(1956年)用X-射线结晶法证明了所有的硫甙都具有相同的基本结构,如图1所示。

1530170794800588.jpg

图1 硫甙的基本结构

所有的硫甙都有一个核心结构,是β-D-葡萄糖连接一个磺酸盐醛肟基团和一个来源于氨基酸的侧链。根据侧链R的氨基酸来源不同,可将硫甙分为脂肪族硫甙(侧链来源于蛋氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)、芳香族硫甙(侧链来源于酪氨酸和苯丙氨酸)及吲哚族硫甙(侧链来源于色氨酸)。不同的侧链决定了水解产物的不同[3]。迄今为止已发现的硫甙超过120种[4]。

    硫甙在植物中不是单一存在的。植物中存在硫甙-葡萄糖硫甙酶(Glucosinolate-Myrosinase)体系,在完整的植物中,葡萄糖硫甙酶存在于特定的蛋白体中,硫甙存在于液泡中,两者是分离的,但当植物细胞组织被破坏的时候,比如在刀切、咀嚼和加工过程中,葡萄糖甙酶(EC3.2.3.1)被释放出来,在一定的温度和湿度条件下,将硫甙水解成一分子葡萄糖、一分子硫酸根和一分子有害物质。硫甙的最初酶解产物是D-葡萄糖和不稳定的糖甙配基。根据侧链的不同,糖甙配基随后重新排列生成异硫氰酸酯、噁唑烷硫酮、硫氰酸酯和腈类等化合物。不同水解条件下的产物有很大的区别,如pH、金属离子和蛋白质的存在等等,都是决定其产物的重要因素。pH在2~5时降解产物以腈为主;pH 5~8时以异硫氰酸酯为主;pH大于8时以硫氰酸酯为主;在EPS酶和Fe2+存在的条件下,以表硫腈为主;如果侧链上含有β-OH,就会环化生成噁唑烷硫酮;侧链为吲哚、苯及其衍生物时,以硫氰酸酯为主。硫甙在无酶(如加热、加压)的条件下也会发生降解,其降解过程十分复杂,主要产物是腈类化合物和异硫氰酸酯,降解产物和降解速度与外界条件有关。温度高,降解反应速度快,生成腈的量大。另外,硫甙的降解速度与体系的含水量有关,体系的含水量低,要在较高温度下发生反应,且降解速度较慢。碱性化学试剂和过渡金属离子都可催化硫甙的降解反应,反应速度随碱性试剂的浓度增加而加快;加压反应速度也会加快[5-7](图2)。

1530170858123638.jpg

图2 硫甙降解途径示意图

2 菜籽饼粕中毒素存在的形式

传统油菜籽制油工艺,油菜籽从原料到成品粕,需经历一系列高温处理,包括软化(60~70 ℃,10~12 min)、蒸炒(125~130 ℃,1.5 h)、预榨(大于130 ℃,0.5 h)、浸出(50~55 ℃,2 h)、脱溶(105~110 ℃,0.75 h)[3]。由硫甙降解途径可知,油菜籽加工时,酶解反应的时间很短,温度大于80 ℃时,芥子酶已钝化,此时大部分硫甙是以热裂解反应降解的。水在硫甙的酶解过程和热裂解过程都起着重要的作用,但高温下,水很快散失,反应速度降下来,而产生的部分腈类、异硫氰酸酯和硫氰酸酯由于易挥发,而进入空气环境中。因此,菜籽饼粕毒素存在的形式,应是未降解的硫甙,残留的少量腈类、异硫氰酸酯、硫氰酸酯和不挥发的噁唑烷硫酮的一个混合体。不同的毒素,其毒性不同,毒性大小依次为:腈类>噁唑烷硫酮>异硫氰酸酯>硫氰酸酯。而完整的油菜籽只含有硫甙。

3 菜籽饼粕毒素分析中存在的问题

3.1 硫甙分析中存在的问题

在选育低硫甙品种的初期阶段,国际上较常用的准确定量硫甙的方法是Wetters和Young的硫脲紫外法[8],它是将测定的菜籽饼粕中异硫氰酸酯和噁唑烷硫酮的含量之和作为菜籽饼粕中硫甙的含量,该方法也一度成为加拿大测定硫甙的国标。该方法被我国学者所借鉴,但由于有些学者对该方法原理的理解不够深入,从而错误地应用了该方法。硫脲紫外法的原理是:将硫甙酶解产生异硫氰酸酯,再与极性氨溶液反应,含β-OH 的异硫氰酸酯环化生成噁唑烷硫酮,不含β-OH 的异硫氰酸酯生成硫脲,噁唑烷硫酮与硫脲分子中都具有一定的共轭体系,物质结构中处于共轭的不饱和碳氢化合物和具有孤对电子的化合物在紫外区245 nm都有特征吸收峰,利用二者的吸光值就可计算出硫甙的含量(见图3)。用ITC▲(mg/g)表示硫甙含量,计算公式为:

     ITC▲=OD245校正×28.55

     OD245校正=OD245-(OD235+OD245)/2

1530170978887623.jpg

 

图3 硫脲紫外法测定原理

如果把极性氨溶液换成乙醇,由于不含β-OH的异硫氰酸酯在没有氨的条件下,就无法生成硫脲;而含β-OH的异硫氰酸酯则在溶剂乙醇中环化生成噁唑烷硫酮,此时得到的吸光值仅仅是噁唑烷硫酮的,这样就可以单独测定噁唑烷硫酮的含量,计算公式为:

     OZT=OD245校正×22.1

     OD245校正=OD245-(OD235+OD245)/2

    这里ITC▲用“▲”标注,正是许多学者容易误解的地方, ITC▲是硫甙的表达方式,它是异硫氰酸酯的量与噁唑烷硫酮的量之和。许多学者误以为ITC▲是异硫氰酸酯的含量,其实该方法是不能直接测定异硫氰酸酯含量的。

    鲍英慧[9]将该方法得到的ITC▲值与国标银量法得到的ITC值比较,得到了二者差异不显著,所得数据真实性值得商榷。因为二种方法测得的毒素不是同一种物质,没有可比性。

    卢炳元等[10]人利用该法,得到菜籽饼粕不同微波处理时间下的硫甙含量(见表1)。用异硫氰酸酯的含量(mg/g)与噁唑烷硫酮的含量(mg/g)之和表示硫甙的含量也是有一定缺陷的。虽然,对于同一原料硫甙的含量(质量分数)是相同,但由于R基不同,硫甙的克分子数是不同的,水解后产生的毒性物质的克分子数也不相同。一分子硫甙降解为一分子毒素,应该是摩尔数的相加(μmol/g),而不是简单的质量分数(mg/g)相加[11]。表1中的ITC表示硫甙的含量,包含了OZT的量,再加上OZT的含量就不对了。

    同时,卢炳元等[10]人在介绍方法时,“称取样品1.5 g”、“加入4~6 mg粗芥子酶粉”、以及“用油菜籽制备粗芥子酶粉”都与标准方法有差异,应该“称取样品0.1 g”、“加入30~50 mg粗芥子酶粉(精芥子酶才是4~6 mg)”、以及“用白芥子制备粗芥子酶粉”。这些错误很容易给引用其参考文献者带来很大的误导作用。其得到的结果也是值得商榷的。

表1 不同处理时间样品的硫甙含量

1530171052827226.jpg

引自卢炳元等,2008

此外,该法是用于测定油菜籽中硫甙含量的,因为油菜籽中毒素存在的形式只有硫甙,不含其他毒素,可利用一分子硫甙酶解产生一分子毒素的原理,测定其降解产物噁唑烷硫酮、异硫氰酸酯的含量来推算出硫甙的含量。许多学者将该法改进用于菜籽饼粕中硫甙的测定[12-14],而菜籽饼粕却是一个多毒素混合体,不仅含有硫甙,还含有游离的噁唑烷硫酮、异硫氰酸酯、硫氰酸酯和腈类。如果还利用该法计算菜籽饼粕中的硫甙,就把游离的噁唑烷硫酮、异硫氰酸酯一并算入硫甙了,没有实际意义。

    另外,即使用该法测定油菜籽中硫甙含量,它还存在着另一个被忽视的问题。因为只有脂肪族的硫甙酶解时产生异硫氰酸酯和噁唑烷硫酮,而某些硫甙如酚基硫甙、吲哚基硫甙、苄基硫甙,它们酶解时不产生异硫氰酸酯和噁唑烷硫酮。因此,这些硫甙无法用该法测定。

    正因为存在如此多的问题,加拿大在20世纪90年代就已经废除该国标方法,不再应用。而目前,我国关于菜籽饼粕中硫甙的测定,还没有国家标准,仍有许多学者热衷于此法,这对我国硫甙的研究是不利的。

    测定菜籽饼粕中完整的硫甙,可以选择氯化钯比色法或高效液相色谱法。

3.2 噁唑烷硫酮分析中存在的问题

关于菜籽饼粕中噁唑烷硫酮的测定,我国有国家标准(GB/T 13089—1991)。标准的原理是用芥子酶将硫甙酶解,然后用乙醚萃取生成的噁唑烷硫酮,用紫外分光光度计测定[15]。

    GB/T 13089—1991中,用粗酶酶解硫甙,所添加的粗酶用量仅为经验值。一般的酶都有酶活单位。而自制粗酶时,不同的实验者以及不同的白芥子原料所制备的粗酶酶活单位肯定不同,这就可能导致在测某些高硫甙含量的菜籽饼粕时,不能使硫甙完全水解,从而导致测定结果偏小。所以应该规范酶活单位和酶的用量。

    此外,菜籽饼粕中含有完整的硫甙以及游离的噁唑烷硫酮、异硫氰酸酯、硫氰酸酯和腈类。这种菜籽饼粕被动物采食后,进入动物胃肠道,胃环境pH一般2.0左右,由前面的硫甙降解途径得知,此时,硫甙的降解产物以腈类为主;而在肠道,大量的微生物群可能会以硫甙为食物而将硫甙代谢掉,不产生任何毒素,或者硫甙以完整的形式进入血液和组织器官中。所以,将菜籽饼粕所有完整硫甙全部定向酶解产生噁唑烷硫酮加上原本游离的噁唑烷硫酮来表示菜籽饼粕中的噁唑烷硫酮的含量是不严谨的。测定菜籽饼粕中噁唑烷硫酮的含量最好只测定游离的噁唑烷硫酮,而不用芥子酶将硫甙酶解。

3.3 异硫氰酸酯分析中存在的问题

关于菜籽饼粕中异硫氰酸酯的测定,国家标准(GB/T 13087—1991)给定了两种方法,即气相色谱法和银量法。存在的问题和噁唑烷硫酮一样,一个是粗酶用量问题,另一个是测定菜籽饼粕中异硫氰酸酯的含量最好只测定游离的异硫氰酸酯,而不用芥子酶将硫甙酶解。

    此外,同是测定异硫氰酸酯,气相色谱法和银量法在菜籽饼粕的前处理上却存在很大的差异。气相色谱法不要求菜籽饼粕烘干水分,不需要脱脂处理,酶解在pH 7.0缓冲液条件下进行;而银量法却要求样品含脂率大于5%时需脱脂处理,且测定时样品要烘至绝干,酶解却是在pH 4.0缓冲液条件下进行[16]。这就给比较二者的相关性带来了很大的困难,造成二者的相关性很不好,测定的结果差异性很大。

3.4 腈类分析中存在的问题

腈类是菜籽饼粕毒素中毒性最大的一类物质。油菜籽加工过程中,硫甙降解途径主要以高温高湿高压下的热裂解为主,由硫甙降解途径可知,此时主要的产物是腈类。腈类易挥发,大部分进入空气环境中,残留在菜籽饼粕中的量极微小(1 000 mg/kg以下)。对于饲料中的腈类,其测定方法有国家标准(GB/T 13084—1991),但仅针对的是常量的腈类(1 000 mg/kg以上),其检测限不适用于菜籽饼粕中微量腈类的测定。目前关于微量腈类的测定还没有行业或国家标准。国内外关于微量腈的测定常采用气相色谱法,灵敏度较好,检测限为1~5 mg/kg, 相关系数r为0.998 8~0.999 8,可分离后定量每一种腈。利用化学定氮法也可以测定腈的含量,其是基于腈分子中有一个腈基(  CN ),将腈基转化成酰基、羧基、铵离子或气体氨,由此建立了双氧水酰化法、气氨吸收滴定法、气氨吸收比色法、铵离子滴定法和氨气敏电极法(见图4),借此可以反算出腈的含量,检测限为50~1 000 mg/kg,所测定的为总腈量。

1530171137669129.jpg

图4 腈不同化学定氮法测定途径

不管气相色谱分析还是化学定氮分析,存在的最大问题是菜籽饼粕中微量的腈被大量蛋白质、脂肪、糖类、磷脂、单宁等主体成分所固束,或受其强力干扰,而难以分析得到准确的腈含量。未经分离纯化的样品色谱分析时,色谱峰显示有包络成分,明显失真,误差很大。因此,要想准确定量腈类,关键的一步就是找到腈的纯化步骤[18]。而即使准确定量了菜籽饼粕中微量腈类的含量,也不能真实代表菜籽饼粕的毒性。因为当动物机体采食菜籽饼粕后,残留的硫甙在胃肠道酸性条件下,还是以产腈类为主,对动物造成很大的毒害。

3.5 硫氰酸酯分析中存在的问题

硫氰酸酯是菜籽饼粕中毒性最低的,其本身易挥发,在菜籽饼粕中的含量也是极微量的,其抗甲状腺作用也可通过补碘来加以拮抗。故一般在评价菜籽饼粕毒性大小时,硫氰酸酯很少被考虑,一般都不加以测定。

4 结束语

菜籽饼粕中硫甙的降解途径是个复杂的过程,尤其在动物体内的吸收降解规律,尚未弄清楚,还有待进一步研究。

    目前,关于菜籽饼粕中毒素的测定,我国还没有一个规范的标准,这就给菜籽饼粕品质的毒性大小评价带来了很大的困难。目前有关专家正着手指定和摸索标准方法。

    菜籽饼粕开发利用前景是光明的,许多新型的制油工艺和脱毒技术正不断产生,能很好地保护菜籽饼粕的蛋白品质和降低毒素的含量,使得菜籽饼粕在配合饲料中的添加量不断增加,能有效地缓和目前蛋白资源匮乏的趋势。

参考文献:

[1] 张宗舟.菜籽饼的营养价值与有毒成分[J].农牧产品开发,2001(4):9-10.

[2] 郭兴凤.硫葡萄糖甙及其降解物分析法研究进展[J].郑州粮食学院学报,1992(1):91-99.

[3] 尚毅.影响甘蓝型双低油菜籽粒中硫代葡萄糖苷含量稳定性的研究[D]. 陕西 杨凌:西北农林科技大学,2003.

[4] CHEN S, ANDREASSON E. Update of glucosinolate metabolism and transport[J]. Plant Physiol Biochem, 2001,39:743-758.

[5] 修丽丽,钮昆亮.十字花科植物中的硫代葡萄糖苷及其降解产物[J].浙江科技学院学报,2004,16(3):187-189.

[6] 李娟,朱祝军.植物中硫代葡萄糖苷生物代谢的分子机制[J].细胞生物学杂志,2005,27:519-524.

[7] 周锦兰,胡建华.硫代葡萄糖甙的结构及降解特性[J].武汉工业学院学报,2003,22(1):58-61.

[8] WETTER L R, YOUNGS C G.A thiourea-UV assay for total glucosinolate content in rapeseed meals[J].J Am Oil Chem Soc,1976,53:162-164.

[9] 鲍英慧.比色法测定菜籽饼粕中异硫氰酸酯[J].中国饲料,1999(24):13.

[10] 卢炳元,徐学明.微波处理对油菜籽品质的影响[J].中国油脂,2008,33(4):25-27.

[11] 吴谋成,袁俊华.油菜籽(饼)中硫代葡萄糖甙含量的表示方法及育种指标的讨论[J].作物研究,1988,2(3):1-5.

[12] 张菊珍,徐世前,史美仁.硫脲法测菜籽饼粕中的硫代葡萄糖甙[J].南京化工学院学报,1992,14(2):63-68.

[13] 佘珠花,兰燕丽,吴幼青,等.用硫脲紫外法测定菜籽饼粕中硫代葡萄糖甙的检测分析及讨论[J].中国油脂,2003,28(10):40-41.

[14] 蒋玉琴,邵明诚,黄玲,等.菜籽粕中硫甙的紫外分光光度分析[J].江苏农业学报,1993,9(1):57-59.

[15] GB/T 13089—1991,饲料中噁唑烷硫酮的测定方法[S].

[16] GB/T 13087—1991,饲料中异硫氰酸酯的测定方法[S].

[17] GB/T 13084—1991,饲料中氰化物的测定方法[S]. 

[18] 中科院成都有机化学研究所.腈的分析检测技术研究技术总结报告,课题编号:85-16-04-02(2)[R].成都:成都有机化学研究所,1985.


上一篇:脱脂麦胚提取物抗氧化活性的研究 下一篇:谷朊粉与玉米醇溶蛋白复合膜的制备及 其在榛子仁保鲜中的应用