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微生物发酵提高花生粕营养价值的初步研究

发布日期:2018-08-17 中国油脂网

 

蔡国林1,2,郑兵兵2,王 刚2,曹 钰2,王兴国3,陆 健1,2

(1. 江南大学 工业生物技术教育部重点实验室,江苏 无锡 214122; 2. 江南大学 生物工程学院,

江苏 无锡 214122; 3. 江南大学 食品学院,江苏 无锡 214122)

 

摘要:通过蛋白浓缩、氨基酸平衡、大分子蛋白的降解和有益代谢物的积累等指标考察微生物发酵对花生粕营养价值的改善情况。研究发现,采用干酪乳杆菌JD-17和马克斯克鲁维酵母JD-16进行花生粕的生物技术处理,发酵后的花生粕气味酸甜芳香,具有良好的适口性,粗蛋白从48.2%提高到52.8%,赖氨酸、蛋氨酸和总氨基酸的含量也相应提高,分别提高了15.6%、282%和183%,大分子蛋白明显降解成小分子蛋白,并积累了有益的代谢产物(乳酸含量达到了2.3%)。

关键词:花生粕;蛋白质;氨基酸;发酵

中图分类号:TS229;S816   文献标志码:A   文章编号:1003-7969(2010)05-0031-04

 

Improvement of nutritional value of peanut meal by fermentation

CAI Guolin1,2, ZHENG Bingbing2, WANG Gang2, 

CAO Yu2, WANG Xingguo3, LU Jian1,2

(1. Key Lab of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122,

Jiangsu,China; 2. School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu,China;

3. School of Food Science, Jiangnan University, Wuxi 214122,Jiangsu,China)

 

Abstract:The ability of fermentation to improve the nutritional value of peanut meal was evaluated. Peanut meal was fermented with Lactobacillus casei JD-17 and Kluyveromyces marxianus JD-16 under solid state. After fermentation, the protein was degraded effectively and the crude protein content increased from 48.2% to 52.8%; the content of lysine, methionine and total amino acid improved by 15.6%, 28.2% and 183%, respectively; the content of lactic acid was up to 2.3%. The results showed that the palatability and nutritional value of peanut meal were improved by fermentation.

Key words:peanut meal; protein; amino acid; fermentation

    花生粕是花生仁经压榨提油后的副产品,含丰富的植物蛋白。花生粕的营养价值较高,其代谢能是粕类饲料中最高的,粗蛋白含量达48%以上,精氨酸含量高达5.2%,是所有动植物饲料中最高的,维生素及矿物质含量与其他饼粕类饲料相近似[1]。2008年,中国花生粕产量约为300万t,其独特的优势和相对稳固的市场,是国内粕类产品市场不可或缺的重要成分。然而由于花生粕蛋白质品质欠佳,氨基酸不平衡,赖氨酸含量只有大豆饼粕的一半左右,蛋氨酸和苏氨酸含量也较低,因此只有通过添加合成氨基酸或是添加其他的蛋白质饲料而使氨基酸得到平衡,动物的生长性能才可达到理想水平[2,3];同时花生粕很容易感染黄曲霉菌而产生黄曲霉毒素,这些毒素易使动物的肝脏受到损害,少量黄曲霉毒素就可对动物的生长性能产生显著影响,为了安全,配合饲料中一般控制在10%左右[4,5]。由于花生粕的品质缺陷在一定程度上限制了其在饲料行业的高效利用,因此研究人员主要在拓展花生粕的应用上进行了开发,如将其作为酿造酱油的原料,进行蛋白酶解开发蛋白饮料等[6-8]。而作为大宗的蛋白原料来源,这些开发目前显然不能够充分利用花生粕这种资源。

    因此,本研究从目前成熟的豆粕发酵工艺出发,尝试以酵母和乳酸菌发酵花生粕,均衡其蛋白结构和氨基酸组成,同时形成有益的代谢产物,提高花生粕在饲料行业的营养价值和利用率。

1 材料与方法

1.1 菌种

    卡氏酵母JD-15、马克斯克鲁维酵母JD-16和干酪乳杆菌JD-17均为本实验室保藏菌种,其中卡氏酵母JD-15和马克斯克鲁维酵母JD-16是经过AEC诱变获得的赖氨酸积累突变株。

1.2 材料

    花生粕,由山东鲁花集团提供。

1.3 培养基

    YPG培养基:酵母膏5 g, 蛋白胨10 g, 葡萄糖20 g, 加水至1 000 mL, 自然pH, 固体培养基加入2%的琼脂。MRS培养基:葡萄糖10 g, 酵母提取物5 g, 肉类浸膏10 g, 蛋白胨10 g, 吐温-80 1 mL, K2HPO4 2 g, NaAc 5 g, MgSO·7H2O 0.2 g, MnSO4 0.04 g, 柠檬酸三铵2 g, pH 5.5, 固体培养基加入2%的琼脂。

1.4 发酵工艺

    针对花生粕存在的不足,经过菌种的预筛选,设计了6个方案,初步考察微生物发酵花生粕的可行性。花生粕(30 g)和水按1∶ 0.8的比例混合,搅拌均匀后于116 ℃灭菌20 min,冷却后按实验方案(表1所示)接种微生物,接种用的干酪乳杆菌JD-17采用MRS培养基培养12 h,卡氏酵母JD-15和马克斯克鲁维酵母JD-16采用YPG培养基培养18 h。接种后在30 ℃下发酵48 h后,烘干,粉碎。

表1 花生粕发酵工艺设计方案

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1.5 测定方法

151 收得率的测定 准确称量发酵前花生粕至0.01 g,质量记为m1,水分含量为ω1,经发酵烘干后称量记质量为m2,水分含量为ω2,则收得率为:

     E=m2×(1-ω2)/[m1×(1-ω1)]×100%

1.5.2 蛋白含量及氨基酸组成测定[9] 粗蛋白的测定采用凯氏定氮仪测定。氨基酸的测定采用氨基酸自动分析仪测定。

1.5.3 总酸含量的测定[10] 取发酵后的粉碎花生粕(60目)10.00 g(m),加蒸馏水100 mL,于摇床上以100 r/min振动30 min,3 000 r/min离心5 min,取10.00 mL上清液,加入40 mL蒸馏水,滴加3 滴酚酞指示剂,用标定过的0.10 mol/L NaOH滴定至微红。按下式计算总酸含量L(折算成乳酸):

      L=c×(V-V0)×10×9008/(1 000×m)×100%

式中:c——NaOH溶液的浓度,mol/L;

V——样品滴定消耗的NaOH体积,mL;

V0——空白滴定消耗的NaOH体积,mL;

90.08——乳酸的摩尔质量,g/mol。

1.5.4 SDS-PAGE测定[11] 分别取发酵前与发酵后的粉碎花生粕(60目)各1.000 0 g,用0.03 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0) 10.00 mL浸提1 h以上,然后于3 000 r/min、4 ℃离心5 min,取上清液,再于10 000 r/min、4 ℃离心5 min。SDS-PAGE电泳的分离胶浓度为12%,浓缩胶浓度为5%,以溴酚蓝作为前沿指示剂。电泳时,取样品15 μL,加入5 μL的上样缓冲液,混匀后在100 ℃沸水浴中灭活3~5 min,再于10 000 r/min离心30 s。上样量为15 μL,样品在浓缩胶时电压为80 V,待溴酚蓝前沿进入分离胶后增至120 V继续电泳,待溴酚蓝距离下缘仅有0.5~1.0 cm时结束电泳。胶片采用考马斯亮蓝G250染色。

1.5.5 小分子蛋白的测定[12] 准确称取1.000 g经细粉碎的发酵花生粕样品,加入20 mL 去离子水,加入石英砂研磨提取1 h,于8 000×g、4 ℃离心20 min,精确吸取1.0 mL上清液采用凯氏定氮法测定含氮量ρ1(mg/mL);另外精确吸取2.5 mL上清液于超滤管(日本三光纯药株式会社,截留相对分子质量为10 000 Da),8 000×g、4 ℃离心20 min,测定通过超滤膜的清液体积V1,并测定含氮量ρ2 (mg/mL)。则10 000 Da相对分子质量以下的小分子蛋白占可溶性蛋白的比例N按下式计算:

     N=ρ2×V1/(25×ρ1)×100%

2 结果与讨论

2.1 收得率与蛋白质含量的变化

    花生粕经过微生物发酵,如果代谢产生气体,样品会有一定的损失,从而起到蛋白浓缩的作用。微生物发酵对花生粕收得率的影响见图1。从图1可以看出,接入卡氏酵母JD-15和马克斯克鲁维酵母JD-16的花生粕收得率在90%左右,而单纯接入干酪乳杆菌JD-17则对收得率影响不大。这主要是因为酵母在生长代谢时会产生CO2致使收得率下降,而干酪乳杆菌JD-17是同型乳酸发酵菌,不产生CO2。因此,通过测定收得率可初步评价该处理工艺是否合适,如菌株在该发酵基质上代谢生长是否正常。

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图1 微生物发酵对花生粕收得率的影响

    通过收得率只能初步地快速反映蛋白浓缩情况,为了进一步验证蛋白浓缩情况,通过全自动凯氏定氮仪测定微生物发酵前后粗蛋白含量,并比较发酵前后蛋白含量的变化情况,结果如图2所示。

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图2 微生物发酵对花生粕蛋白的影响

    从图2可以看出,卡氏酵母JD-15和马克斯克鲁维酵母JD-16对蛋白浓缩有较好的效果,蛋白提高率都在10%以上,而干酪乳杆菌JD-17对蛋白浓缩的影响不大,这与图1的结果基本一致。

2.2 氨基酸组成的变化

    通过氨基酸自动分析仪测定发酵前后氨基酸的组成,主要考察了赖氨酸含量、蛋氨酸含量和总氨基酸含量的变化情况,结果如表2所示。

表2 花生粕发酵前后氨基酸含量的变化

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    从表2可知,干酪乳杆菌JD-17对赖氨酸、蛋氨酸和总氨基酸的含量变化几乎没有影响,而卡氏酵母JD-15和马克斯克鲁维酵母JD-16是经AEC诱变的用于豆粕发酵中可明显提高赖氨酸含量的菌株,将其用于花生粕发酵中,在提高赖氨酸和蛋氨酸含量上也很明显。在后续的研究中可考虑通过优化工艺来进一步提高必需氨基酸的含量,获得氨基酸平衡的发酵花生粕。

2.3 SDS-PAGE分析

    为考察花生粕发酵前后蛋白的组成结构,进行了SDS-PAGE试验,结果如图3所示。从图3可知,花生粕在发酵之后,大分子蛋白降解明显,特别是方案3和方案5。在豆粕发酵及其工业化的过程中,通过添加蛋白酶制剂可以有效地降解大分子蛋白,但增加了生产成本,并不可取。因此,筛选到适用于大宗饲料原料生物技术处理的微生物菌株是解决生产成本问题的核心之一。干酪乳杆菌JD-17是在豆粕发酵基础上筛选出的具有强降解蛋白能力的菌株,从图3结果可以看出,它同样适用于花生粕的发酵。根据王建峰等[13]人的研究,小肽具有良好的营养价值,与游离氨基酸相比,小肽转运系统具有速度快、耗能低、不易饱和等特点,同时可以改善饲料适口性,减少仔猪腹泻,促进骨骼生长。

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图3 花生粕发酵前后SDS-PAGE图

2.4 总酸含量的变化

  利用乳酸菌发酵饲料原料会产生乳酸,对饲料有酸化作用,而饲料的pH直接影响胃肠道的pH,进而影响诸如胰蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶、淀粉酶、脂肪酶、麦芽糖酶等的功能,影响日粮总的消化率,最终促使动物生长,提高饲料转化率。

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图4 花生粕发酵前后总酸含量的变化

    从图4的结果可以看出,采用干酪乳杆菌JD-17可以提高饲料的总酸含量,在方案3、4和5中,总酸含量都达到了2%以上。

2.5 工艺验证

    综合考虑各个指标,初步选择了干酪乳杆菌JD-17和马克斯克鲁维酵母JD-16的混合发酵工艺,连续进行了3批100 g的验证试验,结果如表3所示。从表3可以看出,采用干酪乳杆菌JD-17和马克斯克鲁维酵母JD-16混合发酵花生粕,可以明显改善其营养价值。

表3 微生物发酵对花生粕营养价值的影响  

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3 结 论

    通过蛋白浓缩、氨基酸平衡、大分子蛋白的降解和有益代谢物的积累等指标,考察了微生物发酵对花生粕营养价值的改善情况。研究发现,采用干酪乳杆菌JD-17和马克斯克鲁维酵母JD-16进行花生粕的生物技术处理,发酵后的花生粕气味酸甜芳香,具有良好的适口性,粗蛋白可以提高10%左右,赖氨酸、蛋氨酸和总氨基酸的含量也相应提高(10%以上),大分子蛋白明显降解成小分子蛋白,并积累有益的代谢产物(乳酸>2%)。同时,由于有益菌的存在对真菌毒素有很强的抑制作用,这有待于下一步的深入研究。

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