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风味蛋白酶水解菜籽蛋白中2S和12S条件的优化

发布日期:2018-08-21 中国油脂网

 董绪燕1,李菊芳1,马 良2,王亚萍2,魏 芳1,陈 洪1

(1.中国农业科学院 油料作物研究所,农业部油料作物生物学重点实验室,武汉430062;

2.西南大学 食品科学学院,重庆 400715)


摘要:通过单因素试验和正交试验,研究了风味蛋白酶对菜籽蛋白中2S(RP-2S)和12S(RP-12S)的水解条件。结果表明,水解RP-2S的最佳酶解条件为底物浓度1%,酶与底物浓度比(E/S)95 LAPU/g,酶解温度50 ℃,pH 7.0,酶解时间3 h,此条件下RP-2S的水解度达33.64%;水解RP-12S的最佳酶解条件为底物浓度1%,酶与底物浓度比(E/S)85 LAPU/g,酶解温度50 ℃,pH 6.6,酶解时间3 h,此条件下RP-12S的水解度达19.97%。

关键词:风味蛋白酶;菜籽蛋白;水解;多肽

中图分类号:TS229;TQ93   文献标志码:A   文章编号:1003-7969(2010)05-0035-03


Optimization of hydrolysis conditions of the 2S and 12S 

protein from rapeseed by flavourzyme

DONG Xuyan1, LI Jufang1, MA Liang2, WANG Yaping2, 

WEI Fang1, CHEN Hong1

(1. Institute of Oil Crops Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences, The Key Lab for 

Biology of Oil Crops, Ministry of Agriculture, Wuhan 430062,China; 2. Food Science

and Technology Department, Xinan University, Chongqing 400715,China)


Abstract:Through the single factor and orthogonal experiment, hydrolysis conditions of 2S and 12S protein from rapeseed by flavourzyme were investigated. The results showed that the optimum hydrolysis conditions of 2S were as follows: substrate concentration 1%, enzyme-substrate ratio (E/S) 95 LAPU/g, temperature 50 ℃, pH 7.0, hydrolysis time 3 h. Under these conditions the degree of hydrolysis was 33.64%. The optimum hydrolysis conditions of 12S were as follows: substrate concentration 1%, enzyme-substrate ratio (E/S) 85 LAPU/g, temperature 50 ℃, pH 6.6, hydrolysis time 3 h. Under these conditions the degree of hydrolysis was 19.97%. 

Key words:flavourzyme; rapeseed protein; hydrolysis; peptides

    20世纪80年代以来,我国是世界上油菜种植面积和产量最大的国家,占世界油菜种植面积和总产量的30%左右。菜籽饼粕蛋白含量高(30%~40%),且具有良好的氨基酸平衡组分,但是菜籽饼粕中还含有硫代葡萄糖苷及一些抗营养因子[1],这些抗营养因子限制了菜籽饼粕的应用。现阶段约有80%的菜籽饼粕被当作肥料使用,造成了蛋白质资源的浪费。菜籽蛋白主要包括12S(RP-12S)球蛋白、2S(RP-2S)清蛋白和转运蛋白。12S球蛋白占蛋白总量的25%~65%,2S清蛋白占蛋白总量的20%[2]。菜籽蛋白水解后得到的菜籽多肽具有良好的溶解性、低黏度、抗凝胶形成性、低抗原性,具有防病、治病、调节人体生理机能的功效,可作为运动营养剂、减肥食品、老年食品等[3,4]。

    由于不同酶对蛋白质的作用位点不同,水解产物也不同。风味蛋白酶是一种中性或微酸性条件下水解蛋白质的真菌蛋白酶/肽酶的复合体,该酶可用于脱除低水解度产物的苦味,同时也可用于水解蛋白质,增进和改善水解液的风味[5]。

    本试验选用风味蛋白酶水解菜籽蛋白中2S和12S组分制备菜籽多肽,通过对不同反应条件的研究确定了风味蛋白酶水解的最佳条件。本研究为提高菜籽蛋白的利用率和开发多肽产品做初步探索。

1 材料与方法

1.1 试验材料

    脱脂菜籽粕:由中国农科院油料所提供的“中双9号”双低油菜籽,经脱皮、脱脂制成脱脂菜籽粕粉。

    低相对分子质量蛋白质Marker,武汉华顺生物试剂有限公司;风味蛋白酶Flavourzyme (500 LAPU/g),诺维信生物制品有限公司;其余试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 菜籽蛋白RP-2S和RP-12S的制备 10.0 g菜籽粕粉溶于200 mL Tris-HCl溶液(pH 7.0),室温下磁力搅拌2 h后15 000 r/min离心2 h,取上清液装入透析袋中4 ℃透析,沉淀12S,上清液15 000 r/min离心1 h,沉淀洗涤3次,冷冻干燥即为RP-12S,上清液冷冻干燥后得RP-2S[6,7]。

1.2.2 菜籽蛋白的水解工艺 称取一定量的RP-2S或RP-12S→溶解至一定浓度、一定pH缓冲液中→混合均匀后加入一定量的风味蛋白酶→混合均匀,置于一定温度水浴锅中酶解3 h→沸水灭酶15 min→离心(5 000 r/min,25 min),收集上清液,测定水解度。

1.2.3 蛋白质含量的测定 按GB/T 5009.5—2003测定。

1.2.4 菜籽蛋白水解度的测定[8] 采用茚三酮显色法测定水解液中的总氨基氮。水解度(DH)按下式计算:

     水解度=水解液中的总氨基氮/水解原料中的总氮×100%

1.2.5 酶解反应条件的优化 为了确定最佳酶解反应条件,首先采用单因素试验,筛选出酶解反应的最佳水平。根据各因素的最佳水平,列出正交试验表进行正交试验,确定酶解反应的最佳条件。 

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 pH对RP-2S和RP-12S水解度的影响 在底物浓度1%,酶与底物浓度比(E/S)75 LAPU/g,酶解温度50 ℃,酶解时间3 h下,考察pH对RP-2S和RP-12S水解度的影响,结果见图1。

    由图1可知,在一定pH范围内,随着pH的升高,RP-2S和RP-12S的水解度逐渐提高。当pH达到6.2时,RP-12S的水解度达到最大,之后随着pH的上升而下降;当pH达到7.0时,RP-2S的水解度达到最大,之后随着pH上升而下降。风味蛋白酶酶解菜籽蛋白RP-2S和RP-12S的最佳pH分别为7.0和6.2。

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图1 pH对RP-2S和RP-12S水解度的影响

2.1.2 温度对RP-2S和RP-12S水解度的影响 在底物浓度1%,酶与底物浓度比(E/S)75 LAPU/g,酶解时间3 h,RP-2S的pH为7.0,RP-12S的pH为6.2条件下,考察酶解温度对RP-2S和RP-12S水解度的影响,结果如图2所示。

    由图2可知,当温度达到50 ℃时,RP-2S和RP-12S的水解度都达到最大值。这是因为适当地加热能使蛋白质结构疏松,暴露出更多的酶作用位点,同时酶活性达到最佳状态,水解度最大。但当温度高于55 ℃时,可能由于酶活性降低,水解度降低。

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图2 温度对RP-2S和RP-12S水解度的影响

2.1.3 酶与底物浓度比(E/S)对RP-2S和RP-12S水解度的影响 在底物浓度1%,酶解温度50 ℃,酶解时间3 h,RP-2S的pH为7.0,RP-12S的pH为6.2条件下,考察E/S对RP-2S和RP-12S水解度的影响,结果如图3所示。

    由图3可知,在E/S为55~95 LAPU/g时,RP-2S和RP-12S的水解度逐渐提高。当E/S达到75 LAPU/g时,RP-12S的水解度增幅减慢,逐渐趋向于水平;当E/S达到85 LAPU/g时,RP-2S的水解度增幅减慢,逐渐趋向于水平。可见在E/S达最佳值之前,底物处于饱和状态,随着E/S的增大,一定时间内水解的肽键数不断增加,但超过最佳值时,过量的酶没有底物作用,导致水解度增加缓慢。在工业化生产中,要综合考虑蛋白质水解度与生产成本之间的关系,确定一个最佳的E/S,以达到低成本高水解度的目的。

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图3 ES对RP-2S和RP-12S水解度的影响

2.2 正交试验

221 风味蛋白酶水解RP-2S的正交试验 根据上述单因素试验结果,确定各因素的3个不同水平,进行L9(34)正交试验,试验结果见表1。

表1 RP-2S的正交试验安排及结果

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    由表1可知,影响RP-2S酶解的3个因素中,温度的影响最大,其次是pH,E/S的影响最小。酶解RP-2S的最佳工艺组合为:最适酶解温度50 ℃,最适pH 7.0,最适E/S为95 LAPU/g。在此最佳工艺参数下进行验证试验,RP-2S的水解度可达3364%。

222 风味蛋白酶水解RP-12S的正交试验 根据单因素试验结果,设计L9(34)正交试验,试验结果见表2。

表2 RP-12S的正交试验安排及结果

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    由表2可知,影响酶解RP-12S的3个因素中,温度的影响最大,其次是pH,E/S的影响最小。酶解RP-12S的最佳工艺组合为:最适酶解温度50 ℃,最适pH 6.6,最适E/S为85 LAPU/g。在此最佳工艺参数下进行验证试验,RP-12S的水解度可达19.97%。

3 结 论

    以双低菜籽粕制备的RP-2S为原料,采用风味蛋白酶对RP-2S进行酶解,底物浓度为1%,E/S为95 LAPU/g,温度50 ℃,pH 7.0,酶解时间为3 h,RP-2S的水解度达33.64%。以双低菜籽粕制备的RP-12S为原料,采用风味蛋白酶对RP-12S进行酶解,底物浓度为1%,E/S为85 LAPU/g,温度50 ℃,pH 6.6,酶解时间为3 h,RP-12S的水解度达19.97%。

参考文献:

[1] 陆恒. 菜籽蛋白的营养优势及食用趋势研究[J]. 现代商贸工业,2004(7):42-45.

[2] 王金梅,张占琴,王学军,等. 菜籽蛋白的制备及其体外模拟消化[J]. 中国油脂,2008,33(9):10-15.

[3] 严奉伟,邓明,朱建飞. 菜籽粕综合利用[J]. 粮食与油脂,2005(9):6-9.

[4] 刘清,谢奇珍,师建芳. 菜籽蛋白活性肽研究[J]. 粮食与油脂,2008(3):4-6.

[5] 熊善柏,赵山,赵思明. 脱脂油菜饼粕中蛋白质的分步酶水解研究[J]. 中国粮油学报,2001(6):102-105. 

[6] ISMOND M A H,WELSH W D. Application of new methodology to canola protein isolation[J]. Food Chem,1992,45:125-127.

[7] LEGER L W,ARNTFIELD S D. Thermal gelation of the 12s canola globulin[J]. J Am Oil Chem Soc,1993,79:853-861.

[8] 赵新淮,冯志彪. 蛋白质水解物水解度的测定[J]. 食品科学,1994(11):65-67.

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