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复合诱变皮状丝孢酵母选育高产油脂菌株

发布日期:2018-10-15 中国油脂网

 李新社1,2,易自力1,陆步诗2,唐鹏程2 

 

(1.湖南农业大学 生物科学技术学院, 长沙 410128; 2. 邵阳学院 生物与化学工程系,湖南 邵阳 422000)

 

摘要:采用紫外线与硫酸二乙酯对皮状丝孢酵母进行复合诱变。研究结果表明:用15 W紫外灯在照射距离30 cm条件下照射60 s,可以筛选到油脂含量30.4%,生物量1.135 4 g/100 mL的突变菌株皮- 60;利用硫酸二乙酯诱变皮-60,在硫酸二乙酯质量分数1.0%,处理时间为70 min条件下,可以筛选到油脂含量35.7%,生物量1.257 3 g/100 mL的突变菌株皮-60-70,较出发菌株,油脂含量提高了33.7%。

关键词:皮状丝孢酵母;紫外线;硫酸二乙酯;复合诱变;微生物油脂

中图分类号:TQ642;TQ92   文献标志码:A   文章编号:1003-7969(2010)07-0031-04

 

Screening of high oil yielding strain by compound 

mutation of Trichosporon cutaneum

LI Xinshe1,2, YI Zili1,LU Bushi2,TANG Pengcheng2

(1.College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128,

China; 2.Department of Biology and Chemistry Engineering,Shaoyang University, 

Shaoyang 422000,Hunan,China)

 

Abstract:Compound mutation of Trichosporon cutaneum with UV and diethyl sulfate(DES) was studied.The result indicated that when the UV lamp was 15W, the irradiation distance was 30 cm and the irradiation time was 60 s, the mutation strain of pi-60 with 30.4% of oil content and 1.135 4 g/100 mL of biomass could be selected. When the DES was applied to the strain pi-60, and the mutation strain (pi-60-70) with 35.7% of oil content and 1.257 3 g/100 mL of biomass could be selected by treating for 70 min with 1.0% DES. Compared with the original strain ,the oil content of the strain pi-60-70 increased by 33.7% .

Key words:Trichosporon cutaneum; UV; DES; compound mutation; microbial oil

    随着日益严重的全球性能源短缺与环境恶化,控制汽车尾气排放,保护人类赖以生存的自然环境成为目前人类急需解决的问题。世界各国的能源研究人员从环境保护和资源的战略角度出发,积极探索发展替代燃料及可再生能源,生物柴油就是其中一种。生物柴油是指以植物油、动物脂肪等可再生资源生产的可用于压燃式发动机的清洁替代燃油[1],其突出的环保性和可再生性,引起了世界发达国家,尤其是资源贫乏国家的高度重视。目前,生物柴油多是利用菜籽油大豆油、回收烹饪油、动物油等为原料制成,这些原料可能受到场地、季节、气候等环境因素及原料来源的影响,因而经济可行性差。

    微生物油脂又称单细胞油脂(Single cell oil,SCO),是酵母、霉菌、细菌和藻类等微生物在一定的条件下,以碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂作为碳源,在菌体内产生的油脂。开发微生物油脂,具有发酵周期短,不受场地、季节、气候影响的优势。美国国家可再生能源试验室(NREL)曾在报告中指出,微生物油脂是生物柴油产业和生物经济的重要研究方向[2]。本试验利用紫外线(UV)和硫酸二乙酯(DES)复合诱变皮状丝孢酵母,以筛选高产油脂菌株,为农产品废料转化油脂提供生产菌,为生物柴油开发提供原料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种 皮状丝孢酵母(GIM 2.68 Trichosporon cutaneum):由广东微生物研究所菌种保藏中心提供。

1.1.2 麦芽汁培养基 由湖南邵阳市百惠啤酒厂提供。

1.1.3 试剂 硫酸二乙酯、琼脂、盐酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、苏丹黑、二甲苯、沙黄、氯仿、甲醇、无水乙醇等均为市售分析纯。

1.1.4 仪器设备 紫外可见分光光度计,恒温培养箱,冰箱,超净工作台,立式高压蒸汽锅,恒温水浴箱,离心机,显微镜,糖度计,电子分析天平,紫外灯等。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基的制备 取1 kg大麦粉,加入55~60 ℃温水4 kg左右,在55~60 ℃水浴锅中保温糖化3~4 h,至液体中加碘无淀粉反应为止。先用纱布过滤,煮沸20 min后分别用定性和定量滤纸各过滤1次,调节含糖量约18 g/100 mL(糖度10 ° Bé),固体培养基的琼脂添加量为1.5%~2.0%。分装后加棉塞并包扎好,121 ℃高压蒸汽灭菌20 min[3]。

1.2.2 菌种的活化与扩大培养 在无菌条件下取少量菌种接种至试管斜面培养基上,28 ℃恒温培养2 d。将菌种活化2~3次。将已活化好的斜面培养基中的菌苔刮到100 mL、pH 7.0的无菌磷酸盐缓冲溶液中,充分摇匀后分别移取2 mL至新鲜的液体培养基中,28 ℃恒温振荡培养2 d。

1.2.3 生长曲线的绘制 取25支20 mL试管,分别装等量(10.0 mL)同种麦芽汁液体培养基灭菌备用。用移液管向每只试管中移取经过充分摇匀含皮状丝孢酵母的培养基0.5 mL,放入摇床发酵培养箱中28 ℃恒温培养。每2 h从培养箱中取出1支试管并且编号放入冰箱冷藏。待所有试管全部拿出时,在600 nm的波长下用紫外可见分光光度计进行检测并记录吸光度。以培养时间为横坐标,吸光度为纵坐标绘制皮状丝孢酵母的生长曲线[4]。

1.2.4 生物量与油脂含量的测定 取活化后的菌种,将斜面培养基上的菌苔刮到pH 7.0的无菌磷酸盐缓冲溶液中,充分摇匀后分别吸取2.0 mL移接到6瓶100.0 mL的液体培养基中,28 ℃恒温培养2 d。取出1瓶置于离心管中在4 500 r/min下离心10 min,收集上清液干燥(干燥温度80 ℃)至恒重,用电子分析天平精确称取干菌体质量,做平行试验3次。另取1瓶分别用冻融法和超声波粉碎法使细胞破裂,然后在4 000 r/min下离心15 min取上清液。再添加适量(约40.0 mL)盐酸水解,室温下静置20 min,再用沸水浴加热10 min,加入适量(约50.0 mL)氯仿-甲醇溶液(2∶ 1),振荡30 min,置于500 mL分液漏斗中分液,取氯仿层,真空干燥除去氯仿即得油脂,用电子天平精确称取油脂质量[5],做平行试验3次。生物量为1000 mL菌液中干菌体的质量,油脂质量为1000 mL菌液中提取所得油脂的质量;油脂含量以油脂质量占干菌体质量的百分比表示。

1.2.5 致死曲线的绘制 将皮状丝孢酵母活化2 d后移入液体培养基中扩大培养,取对数生长期的菌种, 用pH 7.0的无菌磷酸盐缓冲溶液调节菌液浓度为108个/mL。打开紫外灯(15 W)预热20 min,在直径9 cm的无菌平皿中注入10.0 mL菌液,在磁力搅拌器作用下于紫外灯下(15 W、30 cm) 分别照射0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120 s,暗箱保藏2~3 h,在红灯下分别稀释10倍、100倍后各取0.10 mL菌液进行平板涂布,28 ℃恒温培养2 d,统计平板上菌落个数。以照射0 s菌液为对照,计算致死率并绘制紫外线致死曲线[6]。选取致死率为80%左右的诱变时间作为最佳处理时间。将经紫外线诱变选育出的突变菌株进行活化,用pH 7.0的无菌磷酸盐缓冲溶液洗脱并稀释获得菌液浓度为108个/mL的菌悬液。取20.0 mL于三角瓶中,加入质量分数为1.0%的硫酸二乙酯溶液1 mL,置于28 ℃水浴中分别振荡处理10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120 min后,速加过量硫代硫酸钠溶液(约5.0 mL)中止反应。各取菌液0.10 mL,均匀涂布于麦芽汁平板培养基上,28 ℃培养2 d。以平板菌落计数法进行活菌计数,绘制硫酸二乙酯致死曲线图[7]。选取硫酸二乙酯致死率为80%左右的处理时间作为硫酸二乙酯诱变剂量进行试验。

1.2.6 突变菌株的初筛 将在最佳诱变条件下诱变后的菌株在平板上进行涂布、培养,挑取菌落较大且菌落形态与出发菌株的菌落形态有明显不同的菌落进行涂片,用苏丹黑染色15 min,95%的乙醇冲洗,洗脱至无色再用沙黄复染,水洗,风干后镜检。在显微镜下菌丝呈红色,菌体内的脂肪颗粒呈蓝黑色[8],选取油脂含量高的突变菌落进行复筛。

1.2.7 突变菌株的复筛 将初筛后的突变菌株用pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液调节至相同菌液浓度,取2.0 mL接种到100.0 mL液体培养基中,28 ℃恒温振荡培养2 d。通过检测生物量与油脂含量,选出油脂含量最高的菌株,通过连续传代,选育性能稳定的菌株保藏。

2 结果与分析

2.1 皮状丝孢酵母生长曲线的绘制 

    将皮状丝孢酵母活化后,接种在麦芽汁培养基中,28 ℃恒温培养,每2 h取样在600 nm波长下用紫外可见分光光度计进行检测并记录吸光度,以培养时间为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制皮状丝孢酵母生长曲线(见图1)。

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图1 皮状丝孢酵母生长曲线

    由图1可以看出,皮状丝孢酵母的1个生长周期为34 h,从开始培养至12 h为适应期,12~20 h为对数生长期,20~28 h为稳定生长期,28~34 h为衰亡期。选取培养14 h后的皮状丝孢酵母作为诱变出发菌株。

2.2 紫外线诱变结果

2.2.1 皮状丝孢酵母的紫外线致死曲线 将出发菌株在紫外线下照射不同时间,通过平板活菌计数法计数照射后的活细胞含量,计算致死率。以照射时间为横坐标,致死率为纵坐标绘制致死曲线(见图2)。

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图2 皮状丝孢酵母紫外线致死曲线

    图2结果表明, 经过紫外线照射50、60、70 s后皮状丝孢酵母的致死率分别为74.3%、82.5%、89.3%。选取致死率为70%~80%的紫外线照射时间为最佳处理时间进行诱变。

2.2.2 紫外线诱变对皮状丝孢酵母的影响 对诱变后在平板上长出的突变菌株用苏丹黑染色,选取油脂含量高的突变菌株进行干菌体质量和油脂质量检测,结果见表1。

表1 出发菌株和紫外线正突变菌株干菌体

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    由表1可看出,5号菌株的油脂含量为30.4%,较出发菌株油脂含量提高了13.86%,干菌体质量为1.135 4 g,将其命名为皮- 60。

2.3 硫酸二乙酯诱变结果

2.3.1 皮状丝孢酵母的硫酸二乙酯致死曲线 在28 ℃水浴中对皮- 60用硫酸二乙酯处理不同时间后,涂布于麦芽汁固体培养基平板上, 28 ℃恒温培养2 d后, 以平板菌落计数法计算活菌数,统计致死率。以处理时间为横坐标,致死率为纵坐标绘制硫酸二乙酯致死曲线,结果见图3。

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图3 1.0%的硫酸二乙酯处理皮- 60的致死曲线

    图3结果表明, 经过硫酸二乙酯处理60、70、80 min后皮-60的致死率别为72.6%、813%和89.5%。

2.3.2 正交试验确定硫酸二乙酯诱变参数 以硫酸二乙酯的质量分数和处理时间为变量,进行2因素3水平正交试验(见表2)[9],对各试验组致死率与正突变率进行检测,结果见表3。

表2 正交试验因素水平

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表3 致死率和正突变率试验结果

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    表3的试验结果表明, A2B2为最佳组合,即硫酸二乙酯质量分数为1.0%, 处理时间为70 min。

2.3.3 复合诱变正突变菌株的筛选 将活化后的皮-60在28 ℃水浴下用质量分数1.0%的硫酸二乙酯振荡处理70 min , 速加过量硫代硫酸钠溶液中止反应, 取0.10 mL诱变后的菌液均匀涂布于麦芽汁固体培养基上, 28 ℃恒温培养2 d。挑选平板上可疑的变异菌落用苏丹黑进行染色,选取颜色较深的10个菌落作为突变菌株,28 ℃恒温振荡培养2 d后检测其干菌体质量和油脂质量, 结果见表4。

表4 正突变菌株的干菌体质量和油脂质量检测结果

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    由表4可看出,3号菌株干菌体质量、油脂质量最大,且油脂含量高达35.7%,产脂性能最强, 较出发菌株油脂含量提高了33.7%。将其命名为皮-60-70。

2.3.4 出发菌株与突变菌株油脂含量对比 将出发菌株、皮-60、皮-60-70在相同条件下培养后进行油脂含量检测,结果见表5。

 表5 正突变菌株油脂含量与出发菌株油脂含量对比  %

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    由表5可知,出发菌株的油脂含量为26.7%,通过紫外线诱变后,筛选到的突变菌株油脂含量提高到30.4%,再用硫酸二乙酯处理紫外线突变菌株,可以筛选到油脂含量提高到35.7%的突变菌株。

3 结 论

    用15 W紫外灯在照射距离为30 cm条件下照射皮状丝孢酵母60 s,可以筛选到油脂含量304%,生物量1.135 4 g/100 mL的突变菌株皮-60;利用硫酸二乙酯诱变皮-60,在硫酸二乙酯质量分数1.0%,处理时间70 min条件下,可以筛选到油脂含量35.7%,生物量1.257 3 g/100 mL的突变菌株皮-60-70,较出发菌株,油脂含量提高了33.7%。如果采用基因工程、原生质融合等技术对菌种进行改良,或者对筛选到的突变菌株进行最佳培养基探讨及发酵条件优化,油脂产量会有进一步提高。

参考文献:

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