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紫苏籽中不同蛋白组分的功能性质研究

发布日期:2019-06-20 中国油脂网

 刘 宁1,赵 佳1,武选民2,同红娟3,代春吉1,常大伟1,李 超1
(1.陕西科技大学 食品与生物工程学院,西安710021; 2.西安风吹麦浪农产品技术开发有限公司,
西安710003; 3.杨凌子苏生物科技有限公司,陕西 杨凌712100)
 
 
摘要:以紫苏籽为原料,经粉碎过60目筛后石油醚脱脂得到紫苏籽脱脂粉,然后采用不同方法提取得到紫苏籽分离蛋白、清蛋白和球蛋白,研究了3种蛋白的氨基酸组成及持水性、溶解性、乳化性等功能特性。结果表明:紫苏籽脱脂粉中蛋白质含量丰富,不同紫苏籽蛋白的氨基酸组成相近,其中谷氨酸含量最高,且均含有8种必需氨基酸;分离蛋白的热变性温度稍高于其他两种蛋白;清蛋白的持水性、持油性较好;在pH 1~10范围内,3种蛋白的溶解性均呈现出U型变化趋势,其中球蛋白的溶解性最好;在不同pH下,球蛋白的乳化活性和乳化稳定性高于其他两种蛋白。 
关键词:紫苏籽;分离蛋白;清蛋白;球蛋白;功能特性
中图分类号:TS201;TS207.3   文献标识码:A
文章编号:1003-7969(2019)06-0045-05
 
Functional properties of different protein components from perilla seed
LIU Ning1, ZHAO Jia1, WU Xuanmin2, TONG Hongjuan3, 
DAI Chunji1, CHANG Dawei1, LI Chao1
(1.School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, 
Xi’an 710021, China; 2.Xi’an Fengchuimailang Agricultural Products Technology 
Development Co., Ltd., Xi’an 710003, China; 3.Yangling Perilla 
Biotechnology Co., Ltd., Yangling 712100,Shaanxi, China)
 
 
Abstract:The perilla seed was defatted by petroleum ether after being crushed and screened with 60 meshes sieve to obtain defatted perilla seed powder,and perilla seed protein isolate, albumin and globulin were extracted by different methods from defatted perilla seed powder,and the amino acid composition, and functional properties such as water retention, solubility and emulsifying activity of these proteins were examined. The results showed that defatted perilla seed powder was rich in protein. The amino acid compositions of different perilla seed proteins were similar,in which the content of glutamic acid was the highest, and all the proteins contained eight types of essential amino acids. The thermal denaturation temperature of protein isolate was slightly higher than the other two proteins. The albumin represented better water retention and oil retention. In the range of pH 1-10, three proteins showed U-shaped solubility, and the solubility of globulin was the best. At different pH, both emulsifying activity and emulsion stability of globulin were higher than those of the other two proteins.
Key words:perilla seed; protein isolate; albumin; globulin; functional property

植物蛋白具有生产周期短、产量大、资源丰富等优点,越来越多的科研工作者把寻找和开拓新的蛋白质资源及提高蛋白质利用率和附加值作为研究重点\[1\]。紫苏在我国种植广泛,是传统的药食两用植物资源。紫苏籽粕是紫苏籽提油后的副产品,其中蛋白质含量高且杂质少,气味良好且无毒无害,是良好的蛋白质来源。目前,紫苏籽粕仅作为动物饲料或充当肥料等,其自身价值未能得到充分利用\[2\],在高值化利用方面有一定的不足,因此紫苏籽粕具有良好的开发前景。
 
谢超等\[3\]研究了等电点法提取紫苏籽蛋白的最佳工艺条件,最终获得纯度为88.81%(干基)的紫苏籽蛋白。盛彩虹等\[4\]以大豆分离蛋白为对照,研究了紫苏分离蛋白的功能性质,发现紫苏分离蛋白的乳化稳定性与大豆分离蛋白相当。目前,学者们的研究多集中在紫苏籽蛋白的提取工艺,或其中某一种蛋白组分的功能性质,关于紫苏籽中不同蛋白组分的功能性质差异研究较少\[5\]。本文采用碱溶酸沉法提取紫苏籽分离蛋白以及Osborne分级法提取紫苏籽清蛋白、球蛋白,并对3种蛋白质的功能性质进行研究,以期为紫苏资源的开发利用提供理论依据。
 
1材料与方法
 
1.1实验材料
 
紫苏籽,西安风吹麦浪农产品技术开发有限公司;大豆油,中粮集团食品有限公司;甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷、β-巯基乙醇、丙烯酰胺、四甲基乙二胺,生工生物工程有限公司;考马斯亮蓝R-250,美国Sigma公司;其他试剂均为分析纯。
 
K9840凯氏定氮仪,MembrapureA-300氨基酸分析仪,FYY-6D电泳仪,Q2000差示扫描量热仪,FA25高剪切分散乳化机,UV-VS2501PC紫外-可见分光光度计。
 
1.2实验方法
 
1.2.1紫苏籽脱脂粉的制备
 
将紫苏籽用研磨机粉碎,过60目筛,取一定量紫苏籽粉于烧杯中,加入3倍质量的石油醚(沸程60~90℃)在室温下搅拌30min,提取2次,利用旋转蒸发仪除去石油醚,置于通风橱挥干,得紫苏籽脱脂粉,过80目筛,收集备用。
 
1.2.2紫苏籽及其脱脂粉的成分测定
 
粗蛋白质含量、粗脂肪含量、粗纤维含量、水分含量和灰分含量的测定分别参照GB5009.5—2016、GB5009.6—2016、GB/T6434—2006、GB5009.3—2016、GB5009.4—2016进行。
 
1.2.3紫苏籽不同蛋白组分的提取
 
取一定量紫苏籽脱脂粉与去离子水按料液比1∶20混合,用2mol/LNaOH调pH至9,于50℃下搅拌1h后,以8000r/min离心5min,取上清液,用2mol/LHCl将上清液的pH调至4。以8000r/min离心5min,取沉淀用去离子水洗涤3次。用0.5mol/LNaOH调pH至中性,冻干后即得紫苏籽分离蛋白。
 
清蛋白和球蛋白采用Osborne分级法提取\[6\]。将紫苏籽脱脂粉与去离子水按料液比1∶12混合后充分搅拌2h,于4℃下以10000r/min离心30min,重复提取2次取上清液(沉淀收集用于提取球蛋白)。将上清液pH调为4,静置30min,于4℃下以10000r/min离心15min,取沉淀复溶调pH至中性,透析2d,冻干得紫苏籽清蛋白。将清蛋白提取时收集的沉淀用2%的NaCl溶液按料液比1∶12混合搅拌2h,于4℃下以10000r/min离心15min,重复提取2次合并上清液,用HCl将上清液pH调为4,静置30min,于4℃下以10000r/min离心15min,取沉淀复溶,调pH至中性,透析2d后冻干,即得紫苏籽球蛋白。由于常见植物种子中清蛋白、球蛋白功能特性较好\[7\],因此本文不再提取醇溶蛋白、谷蛋白。
 
1.2.4不同蛋白的氨基酸组成分析
 
分别称取一定量的蛋白粉于水解管中,加入5mL6mmol/L的HCl,在110℃烘箱中水解24h后冷却,加去离子水定容到25mL。取1mL水解液于小烧杯中,在60℃烘箱中脱酸后加入1mL柠檬酸钠缓冲液(pH2.2),过0.22μm的滤膜,利用MembrapureA-300氨基酸分析仪测定紫苏籽蛋白的氨基酸组成\[8\](色氨酸经碱水解后测定)。
 
1.2.5SDS-PAGE电泳测定
 
根据Laemmli\[9\]的方法,电泳用浓缩胶质量分数为5%,分离胶质量分数为12%,用0.025mmol/LTris-Gly缓冲液溶解蛋白样品,取10μL样品加入到每个孔中。用0.1%的考马斯亮蓝R-250染液染色180min,洗脱液为甲醇-冰醋酸-水(体积比1∶1∶8),洗脱4次。所得结果与Marker进行对照分析。
 
1.2.6差示扫描量热法(DSC)图谱分析
 
准确称取2mg蛋白样品,置于空铝盘中,加入10μL蒸馏水后密封。用一个空铝盘作为对照,参数设置为:温度扫描范围0~155℃,升温速率6℃/min,氮气流速55mL/min\[10\]。
 
1.2.7不同蛋白的持水性及持油性测定
 
1.2.7.1持水性的测定
 
称取1.0g蛋白样品置于50mL离心管中,向离心管中加入30mLpH为7的去离子水,在常温下搅拌1.5h,以8000r/min离心10min,收集沉淀,记录沉淀与离心管的总质量,按下式计算每克样品对水的保持量。
 
持水性=m2-m0-m1m0
 
式中:m0为蛋白样品的质量,g;m1为离心管质量,g;m2为吸水后蛋白及离心管的总质量,g。持水性单位最后换算成mL/g。
 
1.2.7.2持油性的测定
 
称取1.0g蛋白样品置于50mL离心管中,向离心管中加入20mL食用大豆油,搅拌2min,在常温下静置30min后,以2000r/min离心10min,记录吸油后蛋白与离心管总质量,按下式计算每克样品对油的保持量。
 
持油性=m2-m0-m1m0
 
式中:m0为蛋白样品的质量,g;m1为离心管的质量,g;m2为吸油后蛋白与离心管总质量,g。持油性单位最后换算成mL/g。
 
1.2.8不同蛋白的溶解性测定
 
根据Aluko等\[11\]的方法进行测定。取0.5g蛋白样品与50mL去离子水混合均匀,将蛋白分散液的pH调为1~10,在常温下搅拌1.5h后,以6000r/min离心10min,弃去沉淀,收集上清液,定容到100mL容量瓶中。用凯氏定氮法测定上清液中蛋白质含量,按下式计算蛋白溶解性。
 
溶解性=W2/W1×100%
 
式中:W1为原样品中粗蛋白质质量,g;W2为上清液中粗蛋白质质量,g。
 
1.2.9不同蛋白的乳化活性(EAI)及乳化稳定性(ESI)测定
 
分别配制2%的蛋白溶液,将溶液pH调节为2~9,将大豆油和上述蛋白溶液按1∶3混合均匀,以20000r/min均质1min,量取均质后的乳液50μL,用0.1%SDS稀释100倍后于500nm处测定吸光度\[12\]。按下式计算EAI和ESI。
 
EAI=2×2.303×A0×DFC××θ×10000
 
ESI=A0A0-A10×10
 
式中:EAI为乳化活性,m2/g;DF为乳液稀释倍数,本实验中DF=100;C为蛋白质量浓度,g/mL;为光程,=0.01m;θ为油相体积分数,θ=0.25;ESI为乳化稳定性,min;A0、A10分别为均质后0min和10min时的吸光度。
 
2结果与讨论
 
2.1紫苏籽及其脱脂粉的成分(见表1)
 
 
 
 
由表1可知,紫苏籽中粗脂肪含量较高,达4836%,粗蛋白质和粗纤维含量分别为23.30%和2632%,而紫苏籽脱脂粉中含有较多的粗蛋白质,含量达39.85%,表明紫苏籽脱脂粉是良好的植物蛋白资源。
 
2.2不同蛋白组分的得率
 
实验采用不同方法提取紫苏籽脱脂粉中的蛋白质,结果发现,紫苏籽脱脂粉中蛋白质含量丰富,经碱溶酸沉法提取,分离蛋白的得率为34.75%。分级提取的清蛋白和球蛋白得率分别为12.52%和20.85%。
 
2.3氨基酸组成(见表2)
 
 
由表2可知,紫苏籽蛋白的氨基酸组成丰富,3种蛋白中必需氨基酸种类齐全,谷氨酸和精氨酸含量均较高。因此,摄入紫苏籽蛋白可以满足人体对必需氨基酸的需求,紫苏籽蛋白是一种优良的植物蛋白资源。
 
2.4SDS-PAGE图谱(见图1)
 
 
 
由图1可知,紫苏籽蛋白的SDS-PAGE图谱中均有多条清晰可见的条带,表明紫苏籽蛋白由多个亚基组成。清蛋白与球蛋白具有相似的条带分布,电泳图谱包含4条清晰可见的条带,相对分子质量分别为45、25、20kDa和5~10kDa。分离蛋白的电泳图谱与清蛋白、球蛋白的稍有区别,清晰可见相对分子质量范围分别为25~36kDa和15~20kDa的两个条带,这可能由于分离蛋白采用碱溶酸沉法提取,相比清蛋白、球蛋白提取时的pH更高,能够溶出更大相对分子质量的蛋白组分。
 
2.5DSC图谱(见图2)
 
 
由图2可知,不同紫苏籽蛋白的DSC图谱均只有一个光滑的吸热峰,表明这3种蛋白组分纯度较高,其吸收峰均呈向内凹陷的单吸热峰\[13\]。不同紫苏籽蛋白的热学特性见表3。
 
 

 
 
由表3可知:紫苏籽清蛋白、球蛋白和分离蛋白的热变性温度Td相近,分别为107.36、104.58℃和107.45℃;与其他两种蛋白相比,球蛋白的Td较低。半峰宽ΔTd主要反映蛋白在热变性过程中的协同性\[14\],清蛋白的ΔTd小于其他两种蛋白,表明清蛋白更易在较窄的温度范围发生完全变性\[12\],而分离蛋白完全变性所需的温度范围更宽。
 
2.6不同蛋白的持水性及持油性(见图3)
 
 
由图3可知,紫苏籽清蛋白具有较高的持水性和持油性,分别为3.63mL/g和3.72mL/g,球蛋白和分离蛋白持水性分别为2.36mL/g和2.79mL/g。蛋白颗粒与水接触后,会发生吸水溶胀,有报道称适合做黏性食品的蛋白持水性处于1.49~4.72mL/g范围内\[15\]。持油性对蛋白具有实际应用价值,球蛋白和分离蛋白的持油性分别为2.93mL/g和3.14mL/g,而清蛋白的持油性最高,这可能是因为其分子结构更加开放\[5\]。
 
2.7不同蛋白的溶解性(见图4)
 
 
由图4可知,3种蛋白的溶解性变化趋势较一致,均呈现出U型的溶解性曲线。当pH在等电点附近时,蛋白的溶解性都较低;当pH偏离等电点较远时,蛋白的溶解性均逐渐增大。不同蛋白中,溶解性高低顺序依次为球蛋白、清蛋白、分离蛋白;球蛋白溶解性高于其他两种蛋白,在pH为10时达到最高,为85.3%。
 
2.8不同蛋白的乳化活性(EAI)及乳化稳定性(ESI)(见图5)
 
由图5可知,紫苏籽蛋白的乳化活性与乳化稳定性曲线都表现出U型趋势。当pH为4时,3种蛋白的EAI和ESI均最低,清蛋白分别为26.1m2/g和19.7min,球蛋白分别为25.3m2/g和16.6min,分离蛋白分别为23.2m2/g和7.1min。当pH为9时,3种蛋白的EAI和ESI均最高。同时,当pH偏离等电点时,3种蛋白的EAI及ESI均表现出增加趋势。这与姜文鑫等\[5\]的研究结果较为相近。
 
 
3结论
 
本研究采用碱溶酸沉法和Osborne分级法提取了紫苏籽中分离蛋白、清蛋白和球蛋白,并研究了其功能性质。结果发现:紫苏籽脱脂粉中蛋白质含量丰富,3种蛋白中谷氨酸、精氨酸含量较高,均含有8种必需氨基酸;清蛋白和球蛋白的亚基组成相近,分离蛋白具有较好的热稳定性;清蛋白的持水性和持油性高于其他两种蛋白;在pH1~10范围内,3种蛋白的溶解性均呈现出U型变化趋势,其中球蛋白的溶解性最好;在pH2~9范围内,球蛋白的乳化活性及乳化稳定性均优于其他两种蛋白。

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